豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)orexinb的分布定位

豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)orexinb的分布定位

或飼養(yǎng)因子，也稱為hykorcin，在1998年發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)物理學，包括易感染a和易感染b。OrexinA是含有33個氨基酸殘基的多肽,并有2個鏈內(nèi)二硫鍵,N端是焦谷氨酸殘基,C端酰胺化;而OrexinB是含有28個氨基酸殘基的線性多肽。OrexinA和OrexinB有46%的同源性,并且它們在C端高度保守。2種Orexin都能激活兩個G蛋白偶聯(lián)受體-Orexin受體1(OX1R)和受體2(OX2R),其中OX2R與OrexinA和OrexinB具有相似的親和力,而OX1R與OrexinA的親和力比其與OrexinB的親和力高100～1000倍。Orexins通過其受體發(fā)揮作用,對動物的攝食、能量平衡、睡眠和覺醒、神經(jīng)內(nèi)分泌、生殖活動等均有一定的影響。Orexin神經(jīng)元在腦內(nèi)主要分布于下丘腦,而且在不同種屬的動物其分布存在一定的差異,OrexinA與OrexinB的分布也有一些差異。本研究室已對豬腦內(nèi)OrexinA的分布定位做了研究,但豬腦內(nèi)OrexinB的分布定位尚未見報道。本試驗用免疫組織化學方法對OrexinB免疫陽性神經(jīng)元在豬腦內(nèi)的分布進行了研究,旨在比較兩種Orexin分布的差異,為深入研究OrexinB調(diào)控動物攝食、生殖等生理活動的機理提供形態(tài)學依據(jù)。1材料和方法1.1實驗動物1月齡健康蘇鐘豬10頭,公母各5頭,購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蘇鐘豬種豬場。1.2吉泰科技有限公司OrexinB抗血清(SantaCruzBiotechnologyInc,編號SC-8071),購自上海吉泰科技有限公司。SABC免疫組化染色試劑盒(批號SA1023)包括正常兔血清、封閉液、二抗(兔抗山羊IgG)、SABC(鏈酶親和素—過氧化物酶復合物),DAB顯色試劑盒(批號AR1022)和Polylysine(批號AR0003)購自武漢博士德生物工程有限公司。1.3灌注多聚甲醛/0.1mol/pbs固定液經(jīng)腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(5mL/kg)麻醉蘇鐘豬,手術(shù)暴露心臟,經(jīng)左心室先灌注500mL生理鹽水,再灌注4%多聚甲醛/0.1mol/LPBS固定液。固定后取出腦和脊髓,置同一固定液中后固定4～6h。1.4冰激凌切片制備固定好的組織塊經(jīng)0.1mol/LPBS充分洗滌后,放入20%蔗糖/0.1mol/LPBS溶液中,置4℃待其下沉后作冰凍切片。片厚20μm,裱貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上,室溫干燥后置-20℃冰箱備用。1.5u3000家兔的免疫組化切片經(jīng)37℃恒溫箱干燥3h,按以下程序進行反應:切片先經(jīng)蒸餾水洗滌5min;用新鮮配制的0.5%H2O2/甲醇溶液室溫處理30min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶;蒸餾水洗滌3次;滴加正常兔血清封閉液,室溫作用20min后甩去多余液體;滴加一抗(山羊抗OrexinB多克隆抗體),置4℃冰箱過夜,37℃復溫1h,PBS洗滌2min×3次;滴加二抗(生物素化兔抗山羊IgG),37℃孵育20min,PBS洗滌5min×3次;滴加SABC,37℃作用20min,PBS洗滌5min×3次;滴加DAB,室溫顯色,約10min后鏡檢染色程度;蒸餾水洗滌終止反應,晾干,中性樹膠封片。免疫組織化學染色對照:用PBS代替第一抗體,其它步驟不變。1.6sb2cd-pcr神經(jīng)元/纖維分布檢測有OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維分布的每個核團選取5個典型切面,用明視野顯微鏡OlympusBH22獲取OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維的分布圖像,采用Image-ProPlus10.0軟件進行分析。依據(jù)標記神經(jīng)元的數(shù)目劃分為稀少(20～50個神經(jīng)元)、中等(51～100個神經(jīng)元)和密集(多于100個神經(jīng)元)。依據(jù)標記纖維的稠密程度也劃分為稀少、中等和稠密幾個等級。2免疫陽性神經(jīng)元結(jié)果表明,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維分布于豬下丘腦、腦干和脊髓。在斜角帶、隔區(qū)和終紋床核也有密集的OrexinB免疫陽性纖維分布。免疫陽性神經(jīng)元胞體形態(tài)多樣,胞質(zhì)內(nèi)有棕紅色顆粒沉著,胞核內(nèi)無紅色顆粒沉著(圖1,D、F)。對照試驗結(jié)果為陰性。2.1免疫陽性神經(jīng)元/缺少拉格朗日算法orexinb在下丘腦,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元主要分布于視前區(qū)、室旁核、室周核、后區(qū)、背內(nèi)側(cè)核、外側(cè)區(qū)、穹隆周核、未定帶、乳頭體核、腹內(nèi)側(cè)核和視交叉上核等部位,其中以穹隆周區(qū)、背內(nèi)側(cè)核、未定帶和后區(qū)的OrexinB免疫陽性神經(jīng)元分布較密集,而視前區(qū)和視交叉上核的OrexinB免疫陽性神經(jīng)元分布較少。各核團詳細分布如下:視前區(qū)免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量較少,散在分布,神經(jīng)元胞體較小,突起明顯,多呈雙極和多極形(圖1C)。視交叉上核免疫陽性神經(jīng)元零星分布,胞體呈梭形和卵圓形,多為單、雙極神經(jīng)元。下丘腦室旁核和外側(cè)區(qū)免疫陽性神經(jīng)元分布中等密集,胞體較大,多為卵圓形,突起明顯,多呈雙極和多極形。下丘腦背側(cè)區(qū)免疫陽性神經(jīng)元分布密集,胞體較大,多為圓形或紡錘形的雙極神經(jīng)元(圖1,D、E)。未定帶免疫陽性神經(jīng)元較密集,胞體較大,多呈紡錘形(圖1D)。穹隆周核OrexinB免疫陽性神經(jīng)元圍繞穹隆分布,較密集,胞體較大,突起明顯,多為三角形(圖1A、B)。下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、乳頭體上核和結(jié)節(jié)乳頭體核散在少量OrexinB免疫陽性神經(jīng)元(圖1F)。2.2腦到延髓的核團在腦干,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元分布于從中腦到延髓的許多核團,包括藍斑、前庭神經(jīng)核、下橄欖核、疑核和孤束核(圖2,B、C)。在孤束核,OrexinB陽性神經(jīng)元主要分布于外側(cè)亞核(圖2B)。2.3或exinb陽性器的骨髓分布在脊髓,僅見少量OrexinB免疫陽性神經(jīng)元,分布于頸部脊髓背角第Ⅳ層(圖2A)。2.4不同密度和密度下orexinb免疫陽性纖維分布分布OrexinB免疫陽性纖維為棕褐色,長短不一,多呈彎曲的波浪狀,有的纖維上有膨體,粗細不一,呈串珠狀,在前腦、間腦、腦干和脊髓內(nèi)廣泛分布。在間腦,大量的OrexinB免疫陽性纖維密集分布于隔區(qū)(圖2F)和終紋床核,較低密度的陽性纖維分布于大腦皮質(zhì)、杏仁核和海馬。在下丘腦,OrexinB免疫陽性纖維廣泛分布,在視前區(qū)、視交叉上核、視上核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和未定帶免疫陽性纖維分布較少,但在弓狀核、正中隆起、結(jié)節(jié)乳頭體核和乳頭體上核分布密集。在中腦,中央灰質(zhì)(圖2D)、中縫核、腳間核OrexinB免疫陽性纖維分布密度中等,而在黑質(zhì)、頂蓋和整個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)免疫陽性纖維分布較稀少。在腦橋,密集的OrexinB免疫陽性纖維分布于藍斑(圖2C)。在延髓,孤束核、迷走神經(jīng)背側(cè)運動核和第四腦室底(圖2E)有中等密度的OrexinB免疫陽性纖維分布。在脊髓,OrexinB免疫陽性纖維分布于各個節(jié)段,大量的陽性纖維分布于脊髓背側(cè)角,中等密度的陽性纖維分布于中央管周圍的灰質(zhì)(板層X)。3討論3.1orexinb在髓內(nèi)分布的分布自1998年發(fā)現(xiàn)Orexin以來,研究人員用免疫組化和原位雜交等方法研究發(fā)現(xiàn),在人、鼠、綿羊、雞、猴、兔、蛙和魚腦內(nèi),Orexin免疫陽性神經(jīng)元主要位于下丘腦,并發(fā)出纖維投射到整個腦區(qū),參與多種生理功能的調(diào)節(jié)。文獻中未見有關(guān)豬OrexinB分布定位的報道。筆者用免疫組化法研究了豬腦和脊髓內(nèi)OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維的分布定位。結(jié)果顯示,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維在下丘腦、腦干和脊髓均有分布,在下丘腦,陽性神經(jīng)元和纖維分布于視前區(qū)、視交叉上核、室旁核、室周核、背內(nèi)側(cè)核、穹隆周核、乳頭體核、外側(cè)區(qū)和后區(qū),其中以穹隆周區(qū)、背內(nèi)側(cè)核、未定帶和下丘腦后區(qū)分布較密集,以視前區(qū)、視交叉上核、下丘腦外側(cè)區(qū)和乳頭體核分布較稀少。在腦干,陽性神經(jīng)元分布于藍斑、前庭神經(jīng)核、下橄欖核、孤束核和疑核。在脊髓,陽性神經(jīng)元較少,主要分布于頸部脊髓背角第Ⅳ層。此外,在斜角帶、隔區(qū)、終紋床核等部位觀察到密集的陽性纖維分布。本文結(jié)果與在人和其他動物上的報道既有相似之處也有差異。在蛙,Orexins免疫陽性神經(jīng)元主要分布在視交叉上核、視前區(qū)以及第三腦室周圍;在雞,Orexins免疫陽性神經(jīng)元主要分布在室周核和下丘腦外側(cè)區(qū);在鼠,Orexins細胞體主要集中在下丘腦外側(cè)區(qū)、穹隆周區(qū)、背內(nèi)側(cè)核和下丘腦后區(qū),但在其他腦區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)免疫陽性神經(jīng)元。在綿羊,Orexins免疫陽性神經(jīng)元主要分布于下丘腦背內(nèi)側(cè)核、下丘腦外側(cè)區(qū)、未定帶和穹隆周區(qū),少數(shù)位于下丘腦前區(qū)。在兔,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元分布于下丘腦的室旁核、背內(nèi)側(cè)核、穹隆周核、外側(cè)區(qū)和后區(qū)以及底丘腦的未定帶,以下丘腦背內(nèi)側(cè)核、穹隆周核和外側(cè)區(qū)的陽性神經(jīng)元數(shù)量較多,下丘腦室旁核、后區(qū)和未定帶較少。此外,文獻報道OrexinB免疫陽性神經(jīng)元在延髓極后區(qū)有分布,本研究在豬極后區(qū)未見免疫陽性細胞。本試驗在孤束核和藍斑發(fā)現(xiàn)標記細胞,但文獻中未見報道。筆者在脊髓發(fā)現(xiàn)標記細胞和纖維,文獻中也有采用高效液相法發(fā)現(xiàn)在脊髓存在OrexinB的報道。OrexinB免疫陽性纖維遍布整個中樞神經(jīng)系統(tǒng),與已報道的Orexins的分布基本一致。上述不同種屬動物之間Orexin分布定位的相似性反映了Orexins在進化上的保守性,至于差異性是由于試驗中使用的抗體和方法的不同所致還是確實存在種屬間差異,還有待進一步研究。本實驗室對OrexinA在豬體內(nèi)的分布定位進行了研究,發(fā)現(xiàn)OrexinA免疫陽性神經(jīng)元分布于下丘腦的視前內(nèi)側(cè)區(qū)、室周核、室旁核、視上核、背內(nèi)側(cè)核、穹隆周核、乳頭體核、前區(qū)、外側(cè)區(qū)和后區(qū)等部位,以下丘腦外側(cè)區(qū)、乳頭體核和視上核出現(xiàn)的免疫陽性神經(jīng)元最多。與OrexinA的分布相比較,OrexinB免疫陽性神經(jīng)元的分布位點更為廣泛,但其在各核團的密度不如OrexinA的大。豬體內(nèi)2種Orexin分布的差異提示其功能上可能存在差異,有待深入研究。3.2其他/對攝食的調(diào)節(jié)OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的廣泛分布表明其參與多種生理功能的調(diào)節(jié),包括攝食、能量平衡、睡眠與覺醒、生殖、應激和神經(jīng)內(nèi)分泌等活動。許多文獻報道Orexins主要集中在下丘腦外側(cè)區(qū),因此參與攝食的調(diào)節(jié)。給鼠腦室注射OrexinA對攝食有明顯的刺激作用。給綿羊腦室注射OrexinB,其調(diào)節(jié)攝食的作用只在短期內(nèi)有效。但給豬在外周注射OrexinB,對攝食的影響與對照組相比較差異不顯著。豬下丘腦外側(cè)區(qū)OrexinB免疫陽性神經(jīng)元的分布不如OrexinA密集,也可能與此有關(guān)?？梢奜rexinB對攝食的調(diào)節(jié)作用可能較微弱。視前區(qū)和下丘腦前區(qū)是GnRH分布密集的區(qū)域,參與LH釋放的調(diào)節(jié)。有報道表明未定帶參與生殖功能的調(diào)節(jié),起源于這個區(qū)域的多巴胺、黑色激素凝集素神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)能刺激LH的分泌。OrexinB免疫陽性神經(jīng)元和纖維分布