生血復(fù)元口服液中人參皂苷rg1和人參皂苷re的高效液相色譜法測定

生血復(fù)元口服液中人參皂苷rg1和人參皂苷re的高效液相色譜法測定

生血復(fù)元口服由人參、白術(shù)、當(dāng)歸、陳皮、金雞等中醫(yī)藥組成。具有益氣健脾、清熱解毒的功效。主要用于氣血兩虛證的治療，如氣虛、出汗、心悸、失眠、食欲不振、頭暈和眼痛。人參為方中重要藥物,同時也是貴重藥材,因此以人參中的人參皂苷Rg1和人參皂苷Re為指標(biāo)進(jìn)行含量測定。人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量測定方法主要有UV法、TLCS及HPLC法等。本文參考中國藥典2005年版一部人參藥材項下的含量測定方法,采用HPLC方法測定了生血復(fù)元口服液中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量,為該藥品的質(zhì)量控制提供評價方法。1生血復(fù)元口服液美國Waters高效液相色譜儀(2695系統(tǒng)控制單元,2996二極管陣列檢測器,Empower色譜工作站)。AE240電子分析天平(瑞士METTLER)。生血復(fù)元口服液(批號:081118、081125和090109)由河南百泉制藥有限公司提供;人參皂苷Rg1(批號110703-220424)、人參皂苷Re(批號110754-200320)均為含量測定用對照品,由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇,乙醇、乙腈為色譜純,其余試劑為分析純,水為超純水。2方法和結(jié)果2.1流動相及洗脫溫度色譜柱:AgilentC18柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:以乙腈為流動相A,以水為流動相B,以甲醇為流動相C,按表1進(jìn)行梯度洗脫;柱溫:25℃;流速:1.0mL·min-1;檢測波長:203nm;進(jìn)樣量:10μL。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1計算不低于3000。2.2對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品8.21mg、人參皂苷Re對照品12.61mg,置100mL量瓶中,加甲醇使溶解,并稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液(人參皂苷Rg10.0821mg·mL-1,人參皂苷Re0.1261mg·mL-1)。2.3正丁醇溶液的制備精密吸取生血復(fù)元口服液25mL,用水飽和的正丁醇振搖提取5次,每次20mL,合并正丁醇液,用氨試液40mL洗滌2次,棄去氨液,分取正丁醇液,水浴蒸干,殘渣加甲醇適量使溶解,轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,即得。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍精密吸取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re對照品混合溶液,注入液相色譜儀,分別進(jìn)樣5,10,15,20,25μL,按上述色譜條件測定峰面積,并以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo),進(jìn)行回歸計算,得人參皂苷Rg1在0.04105～0.20525mg·mL-1線性方程Y=3.30×106X-5.09×104(r=0.9997),人參皂苷Re0.06305～0.31525mg·mL-1線性方程Y=2.66×106X-2.24×104(r=0.9994)。2.5對照品測定按處方比例和工藝制成缺人參陰性對照藥,照“2.3”項下方法制備缺人參陰性對照品溶液,精密吸取該溶液10μL,進(jìn)樣測定,結(jié)果陰性對照品液在與人參皂苷Rg1對照品和人參皂苷Re對照品相對應(yīng)的保留時間位置上未見有吸收峰,說明本品中除人參外的其他藥物對含量測定無干擾,見圖1。2.6精密度測試精密吸取同一對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,結(jié)果人參皂苷Rg1峰面積的RSD值為0.7%,人參皂苷Re峰面積的RSD值1.0%。2.7測定初篩值取批號為081118的生血復(fù)元口服液,按“2.3”項下方法操作,制備供試品溶液,分別于0,2,4,6,8,10h按上述色譜條件進(jìn)行測定,,并計算人參皂苷Rg1和人參皂苷Re峰面積的RSD值,結(jié)果人參皂苷Rg1的RSD0.87%,人參皂苷Re的RSD0.54%。2.8標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取批號為081118的生血復(fù)元口服液,制備6份供試品溶液,按上述色譜條件分別進(jìn)樣測定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量,結(jié)果人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的RSD分別為2.08%和1.25%。2.9加樣回收率試驗(yàn)精密吸取已知含量的生血復(fù)元口服液(批號081118)5份,每份15mL,精密加入人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對照品混合溶液(人參皂苷Rg1濃度為0.041051mg·mL-1,人參皂苷Re濃度為0.06305mg·mL-1)15mL,混勻,精密吸取25mL,按“2.3”項下方法操作,制備加樣回收供試品溶液,照上述色譜條件測定,測得人參皂苷Rg1的平均回收率為96.59%,RSD%為0.99%;人參皂苷Re的平均回收率為96.43%,RSD%為0.95%。見表2。2.10樣品測定取不同批號的3批生血復(fù)元口服液樣品,按“2.3”項下方法操作,制備供試品溶液,并按上述色譜條件進(jìn)行測定,結(jié)果見表3。3流動相的選擇人參為本品中的主藥材,為保證臨床用藥的安全有效性,應(yīng)對其有效成分含量進(jìn)行控制。在試驗(yàn)中,曾對本品中的人參皂苷Re、Rg1和人參皂苷Rb1同時進(jìn)行含量測定研究,由于生血復(fù)元口服液中以人參皂苷Re和人參皂苷Rg1為主,人參皂苷Rb1含量較低、且與雜質(zhì)峰無法得到很好的分離,測定誤差較大,因此,選擇人參皂苷Rg1和人參皂苷Re作為本品中的含量測定指標(biāo)。在試驗(yàn)中,曾按《中國藥典》2005年版一部中人參、人參葉、三七、紅參等多種含人參皂苷的藥材及復(fù)方中藥的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn),經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)優(yōu)選,以正文所選流動相,即乙腈—水二元系統(tǒng)梯度洗脫,以甲醇沖洗色譜柱(避免連續(xù)進(jìn)樣帶來的相互干擾),結(jié)果重復(fù)性最佳,出峰時間適宜,峰形尖銳、對稱,且人參皂苷Rg1和人參皂苷Re與雜質(zhì)峰分離較好。樣品溶液制備中,經(jīng)試驗(yàn),水飽和正丁醇萃取5次即可將人參皂苷Rg1和人參皂苷Re提取完全;氨試液洗滌次數(shù)在3次以上時,雖然制備的供試品顏色變淺,樣品HPLC色譜中雜質(zhì)峰吸收度變小,但也會造成人參皂苷類成分的損失,因此,在制備供試品溶液時,用水飽和的正丁醇振搖提取5次、氨試液洗滌2次。本試驗(yàn)中還采用了蒸發(fā)光散射檢測器(WATERS2420型)進(jìn)行對人參皂苷Re和人參皂苷Rg1含量測定,其結(jié)果與紫外檢測器的測定結(jié)果基本一致。考慮到紫外