力竭運(yùn)動(dòng)過程中大鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化

力竭運(yùn)動(dòng)過程中大鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化

根據(jù)初步研究，運(yùn)動(dòng)疲勞后，大鼠圖像高信號(hào)放電源的比例顯著增加，金元爆發(fā)放電活動(dòng)增多，金元興奮增強(qiáng)。初步證實(shí)，條紋體參與了運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)，也是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)疲勞的重要中風(fēng)因素之一。神經(jīng)元間的信息傳遞主要通過神經(jīng)遞質(zhì)實(shí)現(xiàn),故推測(cè)電變化與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)變化有關(guān)。因此,圍繞運(yùn)動(dòng)疲勞與神經(jīng)遞質(zhì)之間的關(guān)系展開研究成為新近關(guān)注的熱點(diǎn)。然而,由于受到研究技術(shù)的限制,目前的研究結(jié)果多以斷頭取腦的方法獲得,只能通過運(yùn)動(dòng)結(jié)束后腦神經(jīng)遞質(zhì)的變化特征間接反映運(yùn)動(dòng)中的狀況,有一定的時(shí)間滯后性。為此,本研究采用微透析和高效液相色譜(highpressureliquidchromatographytechniques,HPLC)聯(lián)用技術(shù),對(duì)一次性力竭運(yùn)動(dòng)過程中大鼠紋狀體細(xì)胞外液神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)變化規(guī)律進(jìn)行活體動(dòng)態(tài)觀察,探討紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)在運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生、發(fā)展和恢復(fù)過程中的變化規(guī)律,并進(jìn)一步解釋運(yùn)動(dòng)疲勞過程中紋狀體神經(jīng)元電活動(dòng)改變的可能機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及原料選用清潔級(jí)健康雄性wistar大鼠8只,8周齡,體重250g±10g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2002-2003,京ICP備05076685號(hào)。常規(guī)分籠飼養(yǎng),自由飲水進(jìn)食,自然光照,動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度20℃±3℃,相對(duì)濕度為40%~60%。1.2試劑與標(biāo)準(zhǔn)液主要儀器:微量注射泵(BAS,MD-0250),微透析探針(BAS,MD-2204),微透析探針套管(BAS,MD-2251),三維立體定位儀(日本成茂,SN-3N),高效液相色譜儀(日本島津LC-20A),熒光檢測(cè)器(日本島津,RF-10AXL),色譜工作站(日本島津),色譜分析柱(日本島津,BDSC18柱,4-6mm×250.0mm,5μm),顱骨鉆(MF-5362,SiliteCorporation)。主要試劑:鄰苯二甲醛(OPA,Sigma),β-巰基乙醇(β-MCE,Sigma),Glu和GABA標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma),甲醇色譜醇(MeOH,Baker),磷酸二氫鉀,四硼酸鈉,無水碳酸鈉等,高效液相所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所有溶液均用超純水(Millipore)配制,并以0.2μM無菌過濾器過濾,冷藏備用。VVGlu和GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取Glu和GABA標(biāo)準(zhǔn)品,分別配置成0.4mmol/L的Glu和0.2mmol/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液;衍生試劑:精密稱取OPA125mg,用2.5ml甲醇溶解后,加入25ml濃度為0.4mol/L的硼酸緩沖液(pH9.5),渦旋混勻,再加入100μlβ-巰基乙醇;人工腦脊液(aCSF):NaCl(126mM),KCl(2.4mM),KH2PO4(0.5mM),MgCl2(0.85mM),NaHCO3(27.5mM),Na2SO4(0.5mM),CaCl2(1.1mM)。1.3骨性標(biāo)志的設(shè)置大鼠以戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉,俯臥固定于腦立體定位儀上,沿大鼠頭頂正中線做矢狀切口,暴露前、后囟及冠、矢狀縫等骨性標(biāo)志。調(diào)整門齒高度,使前囟和后囟處在同一水平面上。依照大鼠腦立體定位圖譜,在紋狀體對(duì)應(yīng)的顱骨部位鉆孔,掀去硬腦膜。將透析套管定植入左側(cè)紋狀體(P:0.2,L:3,H:3.2),并用小螺釘和牙科水泥固定,保證導(dǎo)軌不隨動(dòng)物的正?；顒?dòng)而移動(dòng)或松動(dòng)。術(shù)后4~5d,手術(shù)引起的不良反應(yīng)即可消失,大鼠飲食和行為恢復(fù)正常,開始進(jìn)行恢復(fù)性的遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。1.4增加負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案待大鼠能夠以20m/min的速度跑30min,并未見不良反應(yīng),即可進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。一次性力竭運(yùn)動(dòng)采用本實(shí)驗(yàn)室建立的遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案,跑臺(tái)坡度為0°,負(fù)荷分為3級(jí):I級(jí),8.2m/min,15min;II級(jí),15m/min,15min;III級(jí),20m/min,運(yùn)動(dòng)至力竭。力竭判定標(biāo)準(zhǔn)為:動(dòng)物不能維持預(yù)定跑速,滯留于跑道后擋板不動(dòng),使用光、電、聲刺激驅(qū)趕仍無效,并伴有呼吸急促、俯臥跑臺(tái)、垂頭不起等行為表現(xiàn)。1.5glu和gaba的測(cè)定開啟透析灌流系統(tǒng),調(diào)節(jié)恒流泵控制液體流速為2μl/min,將透析探針插入預(yù)先植入腦內(nèi)的探針導(dǎo)軌,并與人工腦脊液灌流系統(tǒng)直接相連(圖1)。灌流平衡60min后開始運(yùn)動(dòng),在運(yùn)動(dòng)過程中和恢復(fù)期90min內(nèi)收集透析液,采樣頻率為1次/30min,每次采集樣品量為60μl,并及時(shí)放入-20℃冰箱中保存待測(cè)。OPA柱前衍生:準(zhǔn)確提取30μlGlu、GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液或微透析樣品液,再加入0.05mol/L的碳酸鈉溶液15μl和15μl衍生試劑,混勻45s后靜置反應(yīng)30s進(jìn)樣,進(jìn)樣量為25μl。Glu和GABA測(cè)定:采用高效液相色譜(熒光檢測(cè))法(日本島津公司液相色譜儀)。色譜條件:激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)=357nm、發(fā)射波長(zhǎng)(Em)=455nm,柱溫箱25℃,色譜柱為日本島津公司C18柱(5μm,250.0mm×4.6mm)。采用梯度洗脫,流動(dòng)相為A相甲醇:B相磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.6)=40:60;將30μl透析液樣品加入Na2CO3和衍生劑各15μl,混勻45s后靜置30s進(jìn)樣,進(jìn)樣量為20μl。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:精密量取Glu和GABA標(biāo)準(zhǔn)品,分別配成10、1、0.1、0.01和0.001μmol/L的混合溶液,測(cè)定各濃度峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)、以峰面積為縱坐標(biāo),計(jì)算出樣品Glu的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=2681511.8302X+38573.3392(r=0.9994)(圖2A),樣品GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=3170360.4892X+194408.5210(r=0.9999)(圖2B)。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微透析液中各物質(zhì)的含量。采用高效液相色譜分析的方法檢測(cè)Glu和GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品,確定待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間(如圖3A)。然后檢測(cè)大鼠紋狀體的透析液樣品,將Glu和GABA兩種神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行有效分離(如圖3B)。1.6大鼠造林大鼠微透析實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用10%水合氯醛按0.35ml/kg劑量腹腔麻醉大鼠,仰臥位固定四肢。打開胸腔,用4%福爾馬林溶液經(jīng)心臟常規(guī)灌流固定,取出腦組織,冠狀面做切片,對(duì)照大鼠腦立體定位圖譜鑒定探針尖端所在位置(圖4),探針未準(zhǔn)確插入紋狀體的數(shù)據(jù)將被刪除。1.7實(shí)驗(yàn)結(jié)果的描述實(shí)驗(yàn)過程中,采樣是連續(xù)進(jìn)行的,采樣速度是2μl/min,由于分析方法要求的最少進(jìn)樣量為30μl,因此采樣時(shí)間至少需15min以上。本實(shí)驗(yàn)選取30min為一個(gè)點(diǎn),以在某一30min時(shí)間內(nèi)收集到的60μl樣品中的神經(jīng)遞質(zhì)含量反映此時(shí)間段內(nèi)遞質(zhì)的水平。實(shí)驗(yàn)過程中,大鼠不能都正好在整點(diǎn)或半點(diǎn)力竭。為此,將大鼠力竭點(diǎn)所屬的那個(gè)30min時(shí)間段命名為力竭期。大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間個(gè)體差異較大(163.00min±30.12min),但一般都在2h以上,故在力竭期前均至少可收集到2個(gè)或2個(gè)以上的30min樣品,這兩個(gè)點(diǎn)分別定義為力竭期前60min和力竭期前30min;力竭期后的時(shí)間點(diǎn)分別定義為力竭期后30min、力竭期后60min和力竭期后90min。即以力竭期所屬的時(shí)間段為參考,往前取2個(gè)點(diǎn)的樣、往后取3個(gè)點(diǎn)的樣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。為便于區(qū)分大鼠在力竭運(yùn)動(dòng)過程中不同階段紋狀體胞外Glu和GABA水平的動(dòng)態(tài)變化特征,將整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程劃分為4個(gè)階段:安靜狀態(tài)(0);運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅰ(30~60min);運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅱ(力竭期前60min~力竭)和恢復(fù)狀態(tài)(力竭~恢復(fù)90min),運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅰ與運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅱ之間的時(shí)間點(diǎn)忽略,以保證檢測(cè)樣本統(tǒng)計(jì)處理的一致性。以每只大鼠安靜時(shí)透析液物質(zhì)的平均濃度為基礎(chǔ)值,以不同時(shí)間段樣品透析液物質(zhì)濃度占基礎(chǔ)值濃度的百分比反映其變化規(guī)律。所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行RepeatedmeasuresANOVA分析,P<0.05表示差異顯著性。2結(jié)果2.1glu對(duì)gaba和glu的影響圖5顯示,Glu從運(yùn)動(dòng)開始出現(xiàn)上升,力竭期前60min達(dá)到峰值,之后開始下降,在恢復(fù)期30min降到最低點(diǎn),之后又回升。與安靜狀態(tài)相比,Glu水平在運(yùn)動(dòng)60min、力竭期前60min、力竭期前30min、力竭期及其后90min恢復(fù)期內(nèi)均顯著升高(P<0.05,P<0.01)。圖6顯示,GABA水平變化趨勢(shì)與Glu相反,從運(yùn)動(dòng)開始即緩慢下降,從運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅱ開始急劇下降,力竭期前30min下降至最低點(diǎn),之后上升,并在力竭期幾乎達(dá)靜息水平。GABA水平在力竭期前60min、力竭期前30min及力竭期后60min的恢復(fù)期均顯著低于安靜狀態(tài)(P<0.05,P<0.01)。2.2東北部下降、下降、下降、下降由圖7可見,Glu/GABA比值從運(yùn)動(dòng)開始上升,力竭期前60min達(dá)到最高,之后下降,在恢復(fù)期30min降到最低,之后緩慢上升。與安靜狀態(tài)相比,Glu/GABA比值在力竭期前60min、力竭期前30min、力竭期及其后恢復(fù)60min和90min時(shí)均顯著升高(P<0.05,P<0.01)。3glu神經(jīng)元自由基因子檢測(cè)紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)中接收皮層傳入信息的主要核團(tuán),皮層發(fā)出的Glu能神經(jīng)纖維按一定的定位排列投射到紋狀體,再由紋狀體發(fā)出GABA能神經(jīng)纖維,經(jīng)直接或間接通路到達(dá)蒼白球內(nèi)側(cè)部(GPi)/黑質(zhì)網(wǎng)狀部(SNr),經(jīng)丘腦返回皮層。其功能不僅與隨意運(yùn)動(dòng)的執(zhí)行和調(diào)節(jié)有關(guān),而且在運(yùn)動(dòng)可塑性方面也起著關(guān)鍵作用。Glu是腦內(nèi)含量較高的氨基酸,對(duì)神經(jīng)元有興奮調(diào)控作用,屬興奮性神經(jīng)遞質(zhì);GABA在腦組織中有抑制突觸傳導(dǎo)的作用,屬抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。因此,腦組織Glu、GABA含量及其比值常被作為評(píng)定神經(jīng)元興奮性的重要指標(biāo)之一。本研究中,在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅰ,大鼠紋狀體Glu水平及Glu/GABA比值上升,GABA水平下降;而在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅱ至力竭后30min的恢復(fù)期內(nèi),大鼠紋狀體Glu水平及Glu/GABA比值均下降,GABA水平總體上升。我們發(fā)現(xiàn),神經(jīng)遞質(zhì)水平的動(dòng)態(tài)變化與大鼠行為學(xué)表現(xiàn)基本一致。運(yùn)動(dòng)開始時(shí)大鼠體力充沛、精神飽滿;但運(yùn)動(dòng)約30min(運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅰ末)左右出現(xiàn)疲勞癥狀,不能按預(yù)定強(qiáng)度繼續(xù)運(yùn)動(dòng);此時(shí)給予驅(qū)趕、聲、光、電等刺激,大鼠可繼續(xù)維持原有強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)很長(zhǎng)時(shí)間(運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅱ),直到力竭。Potts等研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)引起腦Glu含量增加和Glu/GABA比值下降;而Ishide等的研究發(fā)現(xiàn),短時(shí)間大強(qiáng)度劇烈運(yùn)動(dòng)引起腦Glu升高而GABA降低。這些結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致。神經(jīng)遞質(zhì)Glu含量增加,一方面可能是神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)運(yùn)動(dòng)的一種代償性反應(yīng),增加運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的興奮性,維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的節(jié)律性活動(dòng),促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突觸信號(hào)的傳遞及整合作用,滿足運(yùn)動(dòng)需要。另一方面,關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧的相關(guān)研究證實(shí),Glu具有興奮性毒性作用,即當(dāng)細(xì)胞外液Glu持續(xù)增加到一定濃度時(shí),神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)因過度興奮而損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體內(nèi)Glu含量明顯升高,說明Glu能神經(jīng)元興奮性增強(qiáng);而Glu能神經(jīng)元與紋狀體神經(jīng)元之間存在廣泛的突觸聯(lián)系,疲勞后Glu含量上升可能是導(dǎo)致紋狀體神經(jīng)元高頻放電比例增加、神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)等電活動(dòng)改變的原因之一。GABA則是紋狀體內(nèi)抑制性遞質(zhì),主要通過影響Cl-通道、增加Cl-內(nèi)流而降低運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的興奮性。GABA從運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅱ開始急劇下降,力竭期前30min下降至最低,之后開始上升并在力竭時(shí)達(dá)到靜息水平。這表明大鼠力竭時(shí)紋狀體內(nèi)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸的代謝失衡,抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA活動(dòng)起了主導(dǎo)作用。由此推論,神經(jīng)遞質(zhì)Glu和GABA在運(yùn)動(dòng)疲勞不