nadph氧化酶中nox家族的生物信息學(xué)分析

nadph氧化酶中nox家族的生物信息學(xué)分析

nad-葡萄質(zhì)酶是由膜亞基ep915（即nox）和p22pho、亞甲基p47pho、p67pho、p40pho和rac組成的酶建筑群。它由53c和其他化合物組成：第1代、第3代、第4代、第5代、第7代和第2代。該家族的蛋白質(zhì)分布在大多數(shù)器官、組織和細(xì)胞中。NOX家族蛋白的主要生物學(xué)功能是產(chǎn)生ROS,該途徑生成的ROS能維持細(xì)胞的正常生理活動,但在異常狀態(tài)下,如機(jī)體受到環(huán)境中的超細(xì)微顆粒物UFPs、生長因子、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、鈣離子(Ca2+),以及重金屬鎘、鉻等刺激時,NOX蛋白過表達(dá)產(chǎn)生大量的ROS。研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體內(nèi)增加的ROS引起的氧化壓力與機(jī)體多種疾病,如腫瘤、動脈粥樣硬化、高血壓、再灌注后狹窄等心血管疾病以及阿爾茨海默病、老年癡呆癥等老年性疾病密切相關(guān),所以,NOX家族致病機(jī)理的研究在臨床疾病的預(yù)防、診斷和治療中有重要的意義。本文對NOX家族的表達(dá)、結(jié)構(gòu)、活化模式及其功能做一概述。1nox家族及其亞基的定位和表達(dá)1.1nox1基因人類NOX1基因又名MOX1(mitogenicoxidase1,有絲分裂氧化酶1)或NOH1(NADPHoxidasehomologue1,NADPH氧化酶同源物1)基因,位于X染色體q22。NOX1蛋白含有564個氨基酸,是哺乳動物中第一個被確認(rèn)為gp91phox同源物的氧化酶,與NOX2有60%的同源性。NOX1在結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)有豐富表達(dá),不僅調(diào)節(jié)與組織增生和細(xì)胞分化相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),還參與機(jī)體宿主防御;NOX1在血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、周細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞以及子宮、胎盤、前列腺等細(xì)胞和組織中有低水平表達(dá),但前列腺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤組織及細(xì)胞中有高表達(dá)。1.2呼吸爆發(fā)中nadph氧化酶的催化亞基NOX2是NADPH氧化酶的典型代表,其基因位于X染色體p21.1。NOX2蛋白含有570個氨基酸,是吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)時發(fā)現(xiàn)的NADPH氧化酶的催化亞基,除在吞噬細(xì)胞中有豐富的表達(dá)外,在心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和定向造血干細(xì)胞等非吞噬細(xì)胞中也有分布;在檢測機(jī)體各個器官中NOX家族亞型mRNA的組織分布時發(fā)現(xiàn),NOX2在機(jī)體內(nèi)的分布是最廣泛的,如卵巢、胎盤、甲狀腺、小腸、結(jié)腸、脾、胰腺、前列腺和睪丸等組織中均有分布。1.3nox3是內(nèi)耳的應(yīng)然氧化酶人類NOX3基因定位于6號染色體q25.1-26,其蛋白含有568個氨基酸,與NOX2有56%的氨基酸序列同源性。最初NOX3被定義為在一些胚胎組織如肝臟和腎臟中表達(dá)的酶,但現(xiàn)已證明NOX3是位于內(nèi)耳的一種NADPH氧化酶,在內(nèi)耳的耳蝸、前庭的感覺上皮和螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)有豐富的表達(dá);胎兒脾臟、胎兒腎臟、頭蓋骨和大腦等組織中有較低水平的表達(dá)。鼠內(nèi)耳中豐富表達(dá)的NOX3是耳石形成必不可少的,可能原理是NOX3產(chǎn)生的ROS調(diào)節(jié)二酪氨酸與細(xì)胞外蛋白發(fā)生交聯(lián),形成蛋白質(zhì)沉淀,最終形成耳石的鈣化中心。NOX3突變可造成耳石形成障礙,使鼠出現(xiàn)頭部傾斜的表型;但NOX3與人類耳石的形成無必然聯(lián)系,可能與藥物如順鉑所致的耳毒性有關(guān)。1.4胎和成年腎中nox4mrna的表達(dá)人類NOX4基因位于11號染色體q14.2-q21,含有578個氨基酸,與NOX2僅有39%的同源性。NOX4在胚胎和成年腎臟中有較高表達(dá),又被命名為ReNOX。人腎組織NOX4mRNA檢測顯示,其在髓質(zhì)集合管和腎乳頭上皮細(xì)胞高水平表達(dá),在腎單位的遠(yuǎn)曲小管表達(dá),但在腎小球內(nèi)的表達(dá)水平較低。除了腎臟組織外,NOX4在破骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角蛋白細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、神經(jīng)元以及胰腺、胎盤和胚胎肝組織等細(xì)胞和組織內(nèi)也有表達(dá)。1.5nox的表達(dá)人類NOX5基因位于15號染色體q22.31,其蛋白由565個氨基酸組成,與NOX2的同源性最低,僅為22%~27%。NOX5有六個剪接變構(gòu)體,分別為NOX5α、NOX5β、NOX5γ、NOX5δ、NOX5ε或NOX5-S和NOX5ζ。通常說的NOX5實質(zhì)上是NOX5γ變構(gòu)體,其有最長的編碼序列,因此一般被作為參照序列。NOX5在脾臟、淋巴結(jié)和睪丸中有較高水平的表達(dá),在淋巴結(jié)內(nèi)的表達(dá)主要集中于T、B淋巴細(xì)胞;在血管平滑肌、骨髓、胰腺、胎盤、卵巢、子宮、胃和各種胎兒的生理性組織中有表達(dá)。NOX5還在部分腫瘤細(xì)胞中有豐富的表達(dá),如卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞以及巴雷特食管腺癌細(xì)胞中均有較高的表達(dá)。研究證明,腫瘤細(xì)胞中豐富表達(dá)的NOX5與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。1.6duol蛋白氨基酸序列的變化和來源人類DUOX1和DUOX2亞型基因分別位于15號染色體q21和15號染色體q15.3-q21,其蛋白分別由1551和1548個氨基酸組成。DUOX1和DUOX2蛋白的氨基酸序列有83%的相似性,而DUOX蛋白的氨基酸序列與NOX2有50%的同源性。DUOX1和DUOX2均在甲狀腺內(nèi)大量表達(dá)。但DUOX1在氣道上皮和前列腺內(nèi)也有表達(dá),而DUOX2在唾液腺的管道內(nèi)、直腸的黏膜層,包括十二指腸、結(jié)腸和盲腸在內(nèi)的全程胃腸道管道以及氣道上皮和前列腺中均有表達(dá)。分布于甲狀腺細(xì)胞質(zhì)膜頂部濾泡腔內(nèi)的DUOX蛋白,能提供甲狀腺球蛋白酪氨酸殘基交聯(lián)和甲狀腺過氧化物酶介導(dǎo)的碘化作用所需的H2O2,并能調(diào)節(jié)甲狀腺激素的合成;胃腸道和呼吸道內(nèi)分布的DUOX可能與炎性刺激引起的宿主防御有關(guān)。1.7亞甲基族的調(diào)整1.7.1nadph氧化酶抗體的構(gòu)建人p22phox基因位于16號染色體q24,其蛋白相對分子質(zhì)量約22000,由195個氨基酸組成?？缒喕鵳22phox有兩個主要功能:一是與NOX蛋白結(jié)合,維持NOX蛋白的穩(wěn)定性;二是與組織亞基相互作用,完成NADPH氧化酶復(fù)合體的組裝。研究發(fā)現(xiàn),p22phox在NOX1、NOX2、NOX3和NOX4四個NOX亞型活化時發(fā)揮一定作用,轉(zhuǎn)染實驗敲除p22phox后會導(dǎo)致NOX1~4復(fù)合體的活性降低,但NOX5的活性不受影響。p22phox在成人和胎兒的多數(shù)組織中都有分布,如大腦、心臟、腎臟、肝臟、肺、脾和甲狀腺等。1.7.2與33的體外形態(tài)NOXO1是p47phox的同源物,兩者在NOX活化過程中發(fā)揮組織作用,因此都被稱為組織亞基。p47phox和NOXO1基因分別位于7號染色體q11.23和16號染色體p13.3,相對分子質(zhì)量分別約為47000和41000,分別由390和370個氨基酸組成。p47phox在骨髓細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá),在睪丸、內(nèi)耳、神經(jīng)元、肝細(xì)胞、肝星形細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等組織和細(xì)胞中有低水平的表達(dá);而NOXO1不僅在結(jié)腸內(nèi)有高水平的表達(dá),而且在睪丸、子宮、肝、胰腺、腎臟和內(nèi)耳等組織中均有表達(dá)。NOXO1在結(jié)腸和內(nèi)耳內(nèi)的豐富表達(dá),與NOX1和NOX3在該兩種組織中的高表達(dá)有一定的相關(guān)性。1.7.3蛋白整體結(jié)構(gòu)NOXA1是p67phox的同源物,兩者調(diào)節(jié)了NOX活化及裝配的過程,因此被稱為調(diào)節(jié)亞基。p67phox和NOXA1基因分別位于1號染色體q25和9號染色體q34.3,其蛋白相對分子質(zhì)量約為67000和51000,分別由562和483個氨基酸組成。p67phox在吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、星狀細(xì)胞、腎臟和肝星形細(xì)胞中有表達(dá),而NOXA1在脾臟、內(nèi)耳、胃、結(jié)腸、小腸、子宮、前列腺、肺、甲狀腺、唾液腺、荷蘭豬的胃粘膜細(xì)胞、基底動脈的內(nèi)皮細(xì)胞等組織和細(xì)胞中有表達(dá)。1.7.4p40phol對nox誘導(dǎo)的誘導(dǎo)表達(dá)人p40phox基因位于22號染色體q1,3.1,其蛋白相對分子質(zhì)量大約為40000,由339個氨基酸組成。p40phox在吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其他一些表達(dá)NOX2的細(xì)胞內(nèi)有豐富表達(dá),但在豐富表達(dá)NOX2的血管細(xì)胞內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)p40phox,同時p40phox表達(dá)較高的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)也沒有發(fā)現(xiàn)NOX2。研究表明,p40phox在p47phox缺失時,協(xié)同p67phox和Rac參與了NOX2的活化,可能的機(jī)制是p40phox能夠與膜亞基p22phox結(jié)合。p40phox不是NOX2活化過程中必不可少的亞基,它的存在能夠促進(jìn)NOX2活化;在NOX1、NOX3和NOX4活化復(fù)合體的組裝過程中p40phox不發(fā)揮作用,所以p40phox可能僅存在于表達(dá)NOX2的細(xì)胞中。1.7.5rac對nox3的表達(dá)Rac1、Rac2、Rac3和RhoG共同組成RacGTP酶家族,研究發(fā)現(xiàn)Rac1和RhoG在機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá),Rac2只在造血干細(xì)胞中有表達(dá),Rac3的表達(dá)最初被確定為僅限于神經(jīng)系統(tǒng),但現(xiàn)在認(rèn)為多數(shù)組織中都有表達(dá)。Rac參與調(diào)控NOX1和NOX3的活化過程,但在NOX3活化中是否發(fā)揮作用還有爭議。目前仍沒有證據(jù)表明Rac參與NOX4和NOX5及DUOX等活化的數(shù)據(jù)。2nox家族及其結(jié)構(gòu)2.1n末端的蛋白結(jié)構(gòu)NOX蛋白結(jié)構(gòu)的特異性決定了家族各成員的活性、功能等的差異,七個成員根據(jù)其蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)不同分為三組,NOX家族三組蛋白結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。第一組由NOX1~4四個NOX蛋白組成,它們的蛋白分子包括兩大結(jié)構(gòu)域:部分伸向胞漿的C末端和疏水跨膜區(qū)N末端。其中C末端有一個黃素蛋白脫氫酶區(qū),包含NADPH-和FAD-結(jié)合位點;N末端有六個保守的跨膜區(qū),也叫跨膜α單環(huán)。其中在第三個和第五個跨膜區(qū)各有兩個結(jié)合亞鐵血紅素的保守組氨酸殘基,為帶有兩個不均衡血紅素的鐵提供了支撐軸和遠(yuǎn)端配體?？缒ぢ菪M氨酸殘基的模型表明,兩個血紅素大概位于膜內(nèi)外的小葉上,并且垂直于膜雙層,為氧上丟失的電子經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)NADPH和FAD,穿過膜到達(dá)血紅素,最后穿透細(xì)胞形成活性氧提供了通道。NOX5單獨被列為第二組,除包含有NOX1~4的結(jié)構(gòu)域外,還在N末端有四個EF手結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是鈣離子(Ca2+)的結(jié)合位點,認(rèn)為鈣離子的結(jié)合改變了EF手結(jié)構(gòu),使其更易與催化區(qū)域結(jié)合。NOX家族蛋白的第三組是DUOX氧化酶,它不僅包含NOX1~5的結(jié)構(gòu)域(與NOX5不同的是,其有兩個EF手結(jié)構(gòu)),而且還在N末端有一個髓過氧化物酶樣胞外域,即圖1中的類超氧化物酶樣區(qū)域,也稱第七個跨膜區(qū),因此稱DUOX酶為雙功能氧化酶。2.2mo不同結(jié)構(gòu)的磷酸化程度和同源性調(diào)節(jié)亞基是NOX酶復(fù)合體形成及活化所必需的,其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2。p22phox的N末端與NOX結(jié)合,C末端有一個結(jié)合p47phox的脯氨酸富集區(qū)(prolinerichregion,PRR)。磷酸化的p47phox是NOX活化組裝過程中的觸發(fā)器,包含多元的C末端PRR區(qū)和自動抑制區(qū)(auto-inhibitoryregion,AIR)、中間的bis-SH3區(qū)(Srchomology3,Src同源3結(jié)構(gòu)區(qū))和N末端的吞噬細(xì)胞氧化酶區(qū)(phagocyticcelloxidation,PX)。其中AIR區(qū)包含多個絲氨酸殘基,是磷酸化的激發(fā)位點。NOXO1與p47phox不同的是缺少多元的自動抑制區(qū)和調(diào)節(jié)磷酸化的位點。當(dāng)外源性刺激存在時,p47phox的AIR區(qū)絲氨酸殘基磷酸化,同時PRR區(qū)與p67phox和p40phox的SH3區(qū)結(jié)合,組織胞質(zhì)亞基向胞膜遷移。p67phox和NOXA1僅有28%的同源性,結(jié)構(gòu)上都包括C末端的SH3區(qū)、一個較保守的PB1(PhoxandBem1)區(qū)、一個高度保守的活化區(qū)(activationdomain,AD)和N末端的TPR(tetratricopeptiderepeats)區(qū)。其中SH3區(qū)結(jié)合p47phox,而PB1區(qū)與p40phox的PB1區(qū)的結(jié)合調(diào)節(jié)了p40phox與PHOX調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物的結(jié)合,TPR區(qū)有RacGTPase的結(jié)合位點。但與p67phox不同的是,NOXA1的類PB1結(jié)構(gòu)缺少一個保守的賴氨酸殘基,所以不能與p40phox結(jié)合。p40phox的結(jié)構(gòu)包括一個SH3區(qū)、一個PX區(qū)和一個PB1區(qū),其SH3區(qū)域能夠與p67phoxC末端的SH3區(qū)域一起競爭結(jié)合p47phox的PRR區(qū),表明一些結(jié)合亞基的重排可能發(fā)生在組裝或是活化過程中。3膜結(jié)合亞基的誘導(dǎo)表達(dá)只有當(dāng)NOX家族蛋白亞型與跨膜亞基和胞漿亞基結(jié)合,并組裝成有活性的復(fù)合體后才能發(fā)揮其生物學(xué)功能,其中胞漿亞基向胞膜遷移后與NOX蛋白組裝成復(fù)合體是NOX蛋白活化的基礎(chǔ)。不同的細(xì)胞亞基在NOX酶復(fù)合體組裝及活化的過程中發(fā)揮不同的作用。其中p22phox是膜結(jié)合亞基,不僅參與了NOX蛋白的固定,而且招募胞質(zhì)亞基p67phox、p47phox、p40phox和胞質(zhì)小分子GTP酶結(jié)合蛋白Rac向胞膜移動。p67phox的N末端具有分別與小分子GTP酶結(jié)合蛋白Rac和p40phox結(jié)合的區(qū)域,從而誘導(dǎo)了Rac和p40phox向細(xì)胞膜的遷移。p47phoxC末端的PRR區(qū)可以與p67phoxC末端的SH3區(qū)結(jié)合,從而發(fā)揮募集胞質(zhì)亞基p67phox、p40phox和Rac的作用。p40phox的PX區(qū)與膜磷脂緊密結(jié)合,在NOX2的活化過程中發(fā)揮招募蛋白質(zhì)復(fù)合物的作用。3.1padph氧化酶體的構(gòu)建吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶通常是靜息的,當(dāng)機(jī)體受到外界脅迫因子,如射線、紫外線、重金屬、環(huán)境污染及細(xì)菌等刺激時,NADPH氧化酶胞質(zhì)亞基p47phox發(fā)生磷酸化,導(dǎo)致其構(gòu)象改變,分子間的緊密結(jié)合打開,AIR區(qū)被釋放,同時SH3區(qū)和PX區(qū)暴露出來,隨后p67phox利用其C末端的SH3區(qū)結(jié)合p47phox的PRR區(qū),磷酸化的p47phox攜帶p67phox、p40phox和Rac向細(xì)胞膜遷移,最后利用N末端暴露的SH3區(qū)與伸向胞質(zhì)中的p22phox的PRR區(qū)結(jié)合,最終實現(xiàn)胞膜亞基單位與胞質(zhì)亞基單位在細(xì)胞膜上的集合與裝配,在胞膜上形成有活性的NADPH氧化酶復(fù)合體,該復(fù)合體組裝并產(chǎn)生超氧化物的示意圖如圖3所示。某些靜息的非吞噬細(xì)胞中也有NOX2的表達(dá),活化模式是相同的,只是活性比較低。3.2nox1的活化NOX1的活化需要膜亞基p22phox及胞質(zhì)亞基NOXO1/p47phox、NOXA1/p67phox和Rac1,p40phox不參與NOX1的活化。當(dāng)p47phox缺失時,由于NOXO1磷酸化調(diào)節(jié)位點的缺失和PX區(qū)與靜息細(xì)胞膜結(jié)合能力的喪失,NOX1的活化依賴NOXA1的活化區(qū)域;但當(dāng)NOX1活化時,亞基NOXO1仍舊會與p22phox的PRR區(qū)結(jié)合。當(dāng)NOXO1缺失時,Rac1被激活,Rac-GTP結(jié)合NOXA1的TPR區(qū)域,最終NOX1被Rac-GTP調(diào)控活化。與經(jīng)典的NOX2-p47phox-p67phox-Rac活化系統(tǒng)需要蛋白磷酸化和脂質(zhì)磷酸化不同,NOX1活化系統(tǒng)中Rac1鳥苷酸的改變可能是目前唯一被確定的活化觸發(fā)點,但是NOX1通過Rac1的活化僅在細(xì)胞內(nèi)NOXO1和NOXA1水平較低時發(fā)生。除了NOXO1和NOXA1,NOX1還表現(xiàn)出一種獨特的能力,即當(dāng)細(xì)胞中NOXO1伴隨p67phox表達(dá),或是NOXA1伴隨p47phox表達(dá)時也能活化,但異源亞基調(diào)節(jié)的NOX1活性要比同源亞基調(diào)節(jié)的低。3.3nox3活的調(diào)控NOX3在p22phox存在而其他調(diào)節(jié)亞基缺失的情況下能產(chǎn)生少量的ROS,因為NOX3能與p22phox單獨形成一個復(fù)合物,但調(diào)節(jié)亞基的存在能夠明顯增加NOX3的活性。NOX3活化時,亞基的調(diào)控根據(jù)物種的不同而各異,人的NOXO1在NOXA1或p67phox缺失時能夠調(diào)節(jié)NOX3的活化,但鼠的NOX3活化同時需要NOXO1和NOXA1。目前的研究發(fā)現(xiàn)Rac1在NOX3活化調(diào)節(jié)中不發(fā)揮作用,因為Rac1的顯性失活和組成型激活突變形式均不會影響NOX3的活化。3.4phos1、p65pwell、noxa1的變化在遇到佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)或鈣離子這樣的刺激源時,NOX4均能表現(xiàn)出高度的活性,而且NOX4的活性不受調(diào)節(jié)亞基p47phox/NOXO1、p67phox/NOXA1和Rac的影響,僅與p22phox有密切的相關(guān)性。與NOX1~3活化模式不同的是,NOX4活化不依賴p22phox的PRR區(qū),這可能與p47phox或NOXO1的缺失有關(guān)。免疫共沉淀結(jié)果表明NOX4與p22phox共定位于人的腎組織,這些發(fā)現(xiàn)表明NOX4-p22phox復(fù)合體在沒有其他調(diào)節(jié)亞基輔助時也能產(chǎn)生ROS,其他一些研究也表明一些細(xì)胞中NOX4能夠被迅速激活,但機(jī)制仍不清楚。例如,胰島素在5min內(nèi)能夠激活NOX4產(chǎn)生ROS,這一迅速的反應(yīng)只能靠NOX4蛋白表達(dá)量增加來解釋,而脂多糖通過TLR受體信號級聯(lián)在30min后才能激活NOX4。3.5鈣離子濃度對nox活性的影響除了NOX1~4的基礎(chǔ)NOX催化結(jié)構(gòu)外,NOX5在N末端還有四個結(jié)合鈣離子的EF-手結(jié)構(gòu),研究認(rèn)為鈣離子的結(jié)合改變了EF手結(jié)構(gòu),使其更易與催化區(qū)域結(jié)合,這一過程促使電子從NADPH轉(zhuǎn)移到氧形成超氧化物,所以單獨存在的鈣離子就能激活NOX5,但只有在鈣離子濃度比生理環(huán)境中的鈣離子濃度高時才能誘導(dǎo)NOX5的活化。研究表明,PMA能夠觸發(fā)NOX5T494和S498的磷酸化,增加其對鈣離子的敏感性,所以NOX5的活化可能涉及鈣離子和氨基酸殘基磷酸化通路兩個方面的相互協(xié)調(diào)。3.6duol2p2px抑制劑與其他k-ros的交叉作用人的DUOX酶類似于NOX5,包含EF手結(jié)構(gòu),雖然是兩個而不是四個,但不影響與鈣離子的結(jié)合。鈣離子結(jié)合區(qū)域的存在解釋了在豐富表達(dá)DUOX的甲狀腺細(xì)胞和人類支氣管細(xì)胞中鈣離子觸發(fā)了ROS的產(chǎn)生。報道顯示人類DUOX2能夠與p22phox結(jié)合,但p22phox對DUOX酶的活化僅發(fā)揮很小的作用,甚至不起作用。在經(jīng)典的NADPH氧化酶活化模式中,p22phox是NOX2糖基化和膜上定位所必需的,所以與DUOX蛋白相關(guān)的p22phox也可能發(fā)揮類似的作用。4nox家族的功能4.1nadph氧化酶系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)雖然不同的NOX亞型可能有物種、哺乳動物和組織分布的差異,但NOX家族分布的廣泛性決定了其蛋白功能的全面性。生理過程中的NOX蛋白參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡和細(xì)胞骨架重塑,而且某些NOX亞型具有特殊功能,如宿主防御(NOX2)、內(nèi)耳中耳石的形成(NOX3)、甲狀腺激素的合成(DUOX2)和血管張力的調(diào)控(NOX2)等。NOX家族亞基過表達(dá)或是缺失與機(jī)體多個器官疾病的發(fā)生有一定的相關(guān)性。NOX源性的ROS牽涉到的疾病有慢性肉芽腫疾病、阿爾茨海默病、胃腸道炎癥、高血壓、動脈粥樣硬化、腫瘤、甲狀腺功能減退及囊腫性纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和糖尿病等。NADPH氧化酶的NOX家族主要通過活化后生成的ROS來完成生理病理功能。吞噬細(xì)胞的NADPH氧化酶在靜息細(xì)胞中沒有活性,在病原微生物、炎癥介質(zhì)、外界因子等刺激時活化產(chǎn)生的ROS與機(jī)體宿主防御有關(guān)。與吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶不同的是,非吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶在生理條件下保持一定的活性,產(chǎn)生胞內(nèi)胞外的ROS。通過此途徑產(chǎn)生的ROS并不主要起細(xì)胞防御功能,而是作為“信號分子”和“基因表達(dá)開關(guān)”參與了細(xì)胞分化、增殖、凋亡(細(xì)胞內(nèi)源性的ROS)及細(xì)胞間的信號通路的調(diào)控(細(xì)胞外源性的ROS)。當(dāng)收到胞外因子的刺激信息時,NOX家族蛋白過表達(dá),產(chǎn)生過量的ROS,與人體疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。4.2機(jī)體內(nèi)ros的生成ROS是一類在需氧代謝和有氧環(huán)境中形成,在分子組成上含有氧,且比氧自身有更高化學(xué)活性的物質(zhì)總稱。機(jī)體內(nèi)的ROS有許多種來源,其主要的生成途徑包括環(huán)氧化酶、細(xì)胞色素p450、內(nèi)皮一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)、脂肪氧化酶、線粒體呼吸、NADPH氧化酶NOX家族、黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase,XO)和髓過氧化物酶(MPO)等。4.3其它an型活性氧化學(xué)因素(氧化還原反應(yīng)、電子傳遞、金屬離子催化、藥物等)、物理因素(射線、光、熱等)和生物因素(酶的催化)都可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生高濃度的ROS;同時,許多細(xì)胞在氧化應(yīng)激或是生理代謝過程中均能產(chǎn)生一定量的ROS。機(jī)體產(chǎn)生的這些ROS有兩種類型:一種是外層分子軌道包含一個或多個未成對電子的自由基ROS,包括超氧陰離子自由基(O2·-)、羥自由基(·OH)、過氧亞硝酸鹽自由基(peroxynitrite,ONOO-)和次氯酸鹽自由基(hypochlorite,OCl-)等;另一種是不包含未配對電子,但通過化學(xué)反應(yīng)可轉(zhuǎn)換成自由基ROS的非自由基ROS,包括過氧化氫(hydrogenperoxide,H2O2)、單態(tài)氧、臭氧和氫過氧化物等。各種活性氧的生成過程如圖4所示。機(jī)體內(nèi)NADPH氧化酶NOX家族活化產(chǎn)生的ROS主要是O2·-,而H2O2和·OH分別是O2·-和H2O2的產(chǎn)物。O2·-是NOX蛋白活化的主要產(chǎn)物,通過分子氧一個電子的缺失而形成,具有高度的活性,但壽命較短,通常在水溶液中不會發(fā)生有害反應(yīng),當(dāng)自發(fā)或通過錳超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)催化生成H2O2及金屬離子將H2O2催化生成·OH時才表現(xiàn)出毒性。由于O2·-帶有負(fù)電荷,因此不能穿透細(xì)胞膜,而是通過特定的電壓離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中,作為信號分子參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。O2·-與一氧化氮(nitricoxide,NO)反應(yīng)產(chǎn)生的ONOO-,也是一種參與硝化反應(yīng)的強(qiáng)氧化劑。理論上講,SOD和NO都為O2·-的清除劑,但O2·-通過SOD生成H2O2的速率僅為O2·-與NO反應(yīng)速率的三分之一。4.4ros的劑量迄今為止,國內(nèi)外的研究均已證實ROS的作用存在劑量-效應(yīng)關(guān)系,如海春旭研究表明,加入或通過一定體系激發(fā)產(chǎn)生ROS,其產(chǎn)生的量對細(xì)胞的發(fā)展和歸宿具有劑量-效應(yīng)影響。當(dāng)ROS劑量較低時,可改變細(xì)胞功能或活性狀態(tài);中等劑量可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;劑量過高時則可造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些研究結(jié)果提示,ROS對細(xì)胞功能的影響存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。4.4.1ros信號分子的調(diào)節(jié)作用ROS參與機(jī)體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),與細(xì)胞的發(fā)展及歸宿密不可分。ROS是機(jī)體生理功能的基礎(chǔ),通過直接反應(yīng)調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、修飾蛋白結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄因子和基因,并調(diào)節(jié)它們的功能。ROS參與細(xì)胞生長、分化、凋亡信號和酶活性的調(diào)控,通過刺激炎性因子的產(chǎn)生而參與炎癥反應(yīng),清除病原微生物和外源物質(zhì)。生長因子、細(xì)胞因子或是G蛋白偶聯(lián)受體激動劑活化分泌可以引起細(xì)胞內(nèi)超氧化物和過氧化氫的瞬時升高,而ROS特異性抑制劑或是H2O2清除劑能夠阻斷血小板衍生生長因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)、表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)和血管緊張素II(angiotensinII,AngII)等誘導(dǎo)的信號。所以ROS可能調(diào)節(jié)生長因子和其他因子的信號通路,也可能增強(qiáng)了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。ROS的作用是雙刃劍,適量的ROS的增加可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和凋亡;當(dāng)ROS生成量超過機(jī)體調(diào)節(jié)能力時,則會觸發(fā)細(xì)胞死亡(圖5)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)反應(yīng)過程中具有至關(guān)重