大粒車前子多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎作用

大粒車前子多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎作用

車輛前的種子是對(duì)于干燥的實(shí)驗(yàn)種子的準(zhǔn)分類。例如，決定的cyp通常用于干燥的實(shí)驗(yàn)。椰子的殼含有大量的粘液。這些是由阿拉伯糖、木糖、甘油糖和半乳液糖組成的各種糖。具有全腸排便、降脂、調(diào)節(jié)血糖、減少感染、提高效率、抗炎調(diào)節(jié)、去除自由基等功能。然而，關(guān)于它的抗炎研究很少，關(guān)于它的抗炎酶誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。炎癥是機(jī)體的防御性反應(yīng),通常對(duì)機(jī)體是有利的,但過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)釋放過(guò)多的炎癥性介質(zhì),引起局部或全身的炎癥性反應(yīng)。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)及效應(yīng)細(xì)胞,參與機(jī)體的大多數(shù)免疫反應(yīng),它能清除衰老的宿主細(xì)胞和分子,在機(jī)體抵御感染的過(guò)程中也起到重要的作用,是炎癥過(guò)程的關(guān)鍵角色之一,主要體現(xiàn)在炎癥部位高濃度趨化因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化并向感染部位募集,活化的巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分泌白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)等趨化因子,誘導(dǎo)更多的巨噬細(xì)胞活化募集,釋放IL-6等促炎癥因子及前列腺素等炎癥介質(zhì),誘導(dǎo)和加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)脂多糖(lipopolyssacharide,LPS)刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7建立炎癥細(xì)胞模型,探討車前子多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎作用,不僅為深入研究車前子抗炎活性物質(zhì)及其作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為開發(fā)大粒車前子資源提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1抗氧化酶elisa試劑盒大粒車前子產(chǎn)自江西吉安;RAW264.7細(xì)胞系購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所。RPMI1640培養(yǎng)基美國(guó)Gibco公司;胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline,PBS)、L-谷氨酰胺、β-二巰基乙醇、二甲基亞砜、青霉素、鏈霉素美國(guó)HyClone公司;Griess檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程研究所;LPS美國(guó)Sigma公司;腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)試劑盒、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)ELISA試劑盒、IL-6ELISA試劑盒武漢博士德公司;中性紅溫州市化學(xué)試劑有限公司。1.2酶標(biāo)儀ma公司和bio-rad公司的紡粘設(shè)備3K15-高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Sigma公司;酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Rad公司;CO2培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo公司;倒置顯微鏡日本Olympus公司。1.3方法1.3.1車前子多糖提取采用水提醇沉法從大粒車前子中提取多糖成分,優(yōu)化的提取條件為:大粒車前子粉末與水(1∶10,m/V)在100℃下提取3h,重復(fù)2次。將提取液合并濃縮,80%乙醇沉淀過(guò)夜。4800r/min離心10min收集多糖沉淀,并依次用丙酮、無(wú)水乙醚和無(wú)水乙醇各洗滌2次,干燥得車前子多糖,得率約為10.0%。采用Sevag法對(duì)車前子多糖進(jìn)行脫蛋白處理制備得到精制車前子多糖(PlantagoasiaticaL.crudepolysaccharide,PLCP)。1.3.2生物活性物質(zhì)對(duì)人細(xì)胞的活性檢測(cè)用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100U/mL青霉素及100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(37℃、5%CO2)RAW264.7巨噬細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行分組?？瞻讓?duì)照組:不用LPS處理也不加多糖干預(yù);模型對(duì)照組:加入10mg/L的LPS干預(yù);實(shí)驗(yàn)組:10mg/L的LPS干預(yù),并用PLCP(PLCP終質(zhì)量濃度分別為20、40、80、160μg/mL)處理。1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)RAW264.7巨噬細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL,以每孔100μL接種于96孔板,置于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)3h后洗去未貼壁細(xì)胞。每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,各組按相應(yīng)處理加入LPS、PLCP進(jìn)行培養(yǎng)。24h后每孔加入含中性紅(體積分?jǐn)?shù)0.1%)的生理鹽水溶液100μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄去上清液,用PBS洗3遍,每孔加入細(xì)胞溶解液(V(冰醋酸)∶V(乙醇)=1∶1)100μL,4℃條件下放置2~3h,待細(xì)胞溶解后在酶標(biāo)儀上測(cè)定540nm波長(zhǎng)處的光密度值。1.3.4水培養(yǎng)液用量對(duì)水調(diào)濕結(jié)果的影響采用Griess法對(duì)NO2-定量間接檢測(cè)NO生成。RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,各組細(xì)胞在不同處理因素作用24h后,每孔取細(xì)胞培養(yǎng)液50μL,用Griess試劑測(cè)試,酶標(biāo)儀550nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)NaNO2制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)基中NO的生成量。1.3.5測(cè)定板中不同組分的重取RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,不同組別按照相應(yīng)處理培養(yǎng)24h后,取上清液進(jìn)行測(cè)定。TNF-α、IL-10和IL-6水平的測(cè)定按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。1.4單因素方差分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以u(píng)e0af±s表示,采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)、單因素方差分析,P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖1所示,與模型對(duì)照組相比,PLCP在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(20、40μg/mL)對(duì)LPS激活的RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性具有顯著抑制作用(P<0.05)。2.2plcp作用于lps刺激的no活性由表1可知,和空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組釋放大量NO(P<0.05),PLCP作用于LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞后,NO分泌量下降,PLCP質(zhì)量濃度為40μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞分泌NO活性的抑制效果最為顯著(P<0.05)。2.3plcp對(duì)lps抑制效果由表2可知,PLCP對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子有顯著影響。和模型對(duì)照組相比,在40~160μg/mL范圍內(nèi),PLCP能夠明顯抑制LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6,在20~160μg/mL范圍內(nèi)可顯著抑制LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌IL-10,且呈劑量依賴關(guān)系。3抗炎作用的調(diào)節(jié)作用炎癥反應(yīng)是一種重要的機(jī)體防御過(guò)程,涉及機(jī)體活動(dòng)的許多環(huán)節(jié),其中免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)的激活是炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞,RAW264.7細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞的一種,可激活機(jī)體的免疫系統(tǒng),當(dāng)機(jī)體受LPS等外界因素刺激后,能夠促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生炎癥介質(zhì),發(fā)揮免疫功能。許多研究發(fā)現(xiàn)多糖能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能,并揭示了多糖與其表面受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的作用機(jī)理。因此本實(shí)驗(yàn)以LPS刺激RAW264.7細(xì)胞為模型,探討PLCP對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎作用。巨噬細(xì)胞是一種主要的專職吞噬細(xì)胞,是機(jī)體的清道夫,可以通過(guò)其表面受體識(shí)別并吞噬入侵機(jī)體的病原菌及本身衰老和死亡的細(xì)胞,從而提高機(jī)體機(jī)能。中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)顯示,低質(zhì)量濃度的PLCP能夠抑制RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性,說(shuō)明PLCP可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),并且低質(zhì)量濃度的PLCP能有效地防止巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化。LPS刺激后的巨噬細(xì)胞可大量表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)并分泌大量的NO。NO作為體內(nèi)重要的信使和效應(yīng)分子,對(duì)細(xì)菌等病原體具有殺傷和細(xì)胞毒性作用,從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。但NO的過(guò)量釋放會(huì)損傷正常的細(xì)胞,引起過(guò)度炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)NO對(duì)細(xì)菌感染、創(chuàng)傷等均具有很好的療效。巨噬細(xì)胞NO的合成、分泌與細(xì)胞因子有著相互調(diào)節(jié)作用。當(dāng)PLCP質(zhì)量濃度在40~160μg/mL時(shí),能下調(diào)RAW264.7細(xì)胞釋放NO,這可能與抑制巨噬細(xì)胞的活化、減少與iNOS表達(dá)相關(guān)炎癥因子的釋放有關(guān)。免疫細(xì)胞產(chǎn)生的許多細(xì)胞因子參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié),而植物多糖對(duì)細(xì)胞因子以及受體表達(dá)的影響是其發(fā)揮抗炎作用的重要分子機(jī)制。TNF-α是巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的主要促炎細(xì)胞因子,可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、增殖,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,以正反饋調(diào)控的形式參與許多炎癥反應(yīng),具有重要的生物功能。因此,本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了PLCP對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLCP在40~160μg/mL范圍內(nèi)可顯著抑制RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α,且具有一定的劑量依賴性。由此可以說(shuō)明PLCP可能通過(guò)下調(diào)TNF-α的表達(dá)參與抗炎反應(yīng)。IL-10是一種可由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多功能抗炎細(xì)胞因子,可調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的功能,通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)發(fā)揮抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)PLCP均可顯著抑制IL-10的釋放,并符合劑量依賴關(guān)系。IL-6在先天性免疫和獲得性免疫中都具有突出的貢獻(xiàn),可調(diào)控T淋巴細(xì)胞的分化和激活,誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞的活化,維持調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞間的平衡,在慢性炎癥中發(fā)揮了重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在40~160