山藥多糖的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性研究

山藥多糖的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性研究

山藥是甘薯科多年生蕨類植物的一種曲折。這是中國傳統(tǒng)藥物的同源性食物之一。山藥中的淀粉占其干物質(zhì)的60%~70%,另外含有多糖、黏液蛋白、皂苷、尿囊素和纖維素等多種功能活性成分。多糖是山藥的主要活性成分,占其干物質(zhì)的2.15%~2.92%。以往好多研究均從山藥中直接提取多糖,而將淀粉及其他成分作為殘?jiān)鼜U棄,雖然多糖提取率較高,但淀粉由于糊化變性而大大失去利用價(jià)值。課題組從山藥的工業(yè)化綜合利用出發(fā),先提取淀粉,然后將淀粉提取過程中分離的山藥汁液和纖維殘?jiān)謩e收集并干燥成粉,再進(jìn)一步從中提取山藥粗多糖和其他功能性成分。本研究將研究經(jīng)從山藥汁液干粉中所提取的多糖的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性,為山藥汁液干粉的應(yīng)用、天然安全食品抗氧化劑、免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)研制及山藥的工業(yè)化綜合加工提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1化學(xué)試劑和儀器山藥汁液多糖:準(zhǔn)確稱取山藥汁液噴霧干燥粉,用30倍蒸餾水將其溶解,加入70倍體積的無水乙醇,4℃過夜沉淀,3000r/min離心10min,收集沉淀,干燥得粗多糖。以Sevag法除蛋白得山藥汁液多糖。DPPH(1,1-二苯基苦基苯肼自由基)、Tris(三羥甲基氨基甲烷):美國Sigma公司;30%過氧化氫:天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;印度墨汁和補(bǔ)體:上海信然生物技術(shù)有限公司;高鐵氰化鉀等化學(xué)試劑均為分析純。UNICOWFJ2000型可見光光度計(jì):尤尼柯儀器有限公司;SY-6000小型高速噴霧干燥儀:上海世遠(yuǎn)生物機(jī)械設(shè)備工程有限公司。1.2小鼠人文主義關(guān)懷試驗(yàn)ICR小鼠(SCXK(晉)2007-0001),SPF級(jí),雄性,體重20~25g,6~8周齡,160只,由山西醫(yī)科大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。試驗(yàn)過程中按照3R原則給予小鼠人文主義關(guān)懷?；A(chǔ)飼料由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。各試驗(yàn)均取40只小鼠,隨機(jī)分成4組,每組10只,分籠飼養(yǎng),環(huán)境溫度為(24±2)℃,相對(duì)濕度40%~60%,自由采食和飲水,適應(yīng)性飼喂3d后,開始正式試驗(yàn)。山藥多糖低、中、高劑量組的灌胃(ig)劑量分別為200、600mg/(kg·d),空白對(duì)照組灌胃等體積的蒸餾水。1.3外氧化試驗(yàn)1.3.1三氯乙酸還原穩(wěn)定性測(cè)定取pH6.6的磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5mL,加入樣品液lmL,混勻后50℃水浴20min,然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸溶液2.5mL,混勻,3000r/min離心10min,取上清2.5mL,加入蒸餾水和0.1%氯化鐵各2.5mL混勻,靜置10min,在700nm處測(cè)定吸光度值,吸光度值越高,抗氧化性越好,還原力越強(qiáng)。1.3.2抗氧化酶dpph法取樣品液2mL,加入2mL0.0001mol/LDPPH溶液(溶于95%的乙醇),混勻后在室溫下避光反應(yīng)20min,1000r/min離心10min,在517nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)i;空白組為2mL樣品液加入2mL95%的乙醇溶液測(cè)定吸光值為Aj;對(duì)照組為2mLDPPH溶液與2mL蒸餾水混合在517nm下測(cè)吸光值為Ac;并以等體積蒸餾水和95%的乙醇混合液作為空白調(diào)零。清除率按下式計(jì)算。1.3.3硫酸亞鐵的清除實(shí)驗(yàn)樣品組試管中依次加入pH值為7.4的0.4mol/L磷酸緩沖液,0.0025mol/L鄰二氮菲溶液,樣品液,0.0025mol/L硫酸亞鐵溶液各1mL,0.02mol/LH2O20.5mL;損傷組中用lmL蒸餾水代替樣品液;空白組中用1.5mL蒸餾水代替樣品液和H2O2溶液。37℃恒溫水浴中反應(yīng)lh,快速記錄536nm處的吸光值。按下式計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除率。式中:A樣品為加入樣品液的·OH體系的吸光值;A空白為不加H2O2的·OH體系的吸光值;A損傷為加H2O2不加樣品液的·OH體系的吸光值。1.3.4鄰苯三酚的自氧化速率依次加入4.5mL0.050mol/LpH8.34的磷酸緩沖液,0.3mL0.0002mol/L鄰苯三酚,0.3mL樣品,蒸餾水補(bǔ)充至9.0mL。25℃反應(yīng),5min內(nèi),每30s讀取一次322nm處的吸光值。用蒸餾水代替樣品液,以吸光值A(chǔ)與時(shí)間t做線性關(guān)系圖,斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率V0。對(duì)于加入樣品液后的反應(yīng)體系,求出的斜率即為加入樣品液后鄰苯三酚的自氧化速率Vt。按下式計(jì)算樣品對(duì)O2·-的清除率。1.4對(duì)具體免疫的影響免疫分為非特異性的先天性免疫和特異性的獲得性免疫,獲得性免疫又分為體液免疫和細(xì)胞免疫。評(píng)價(jià)某種物質(zhì)對(duì)免疫功能的影響時(shí),應(yīng)該對(duì)組成免疫力的上述三方面進(jìn)行全面評(píng)價(jià),每一方面的評(píng)價(jià)又有許多不同的方法,本研究分別選取了碳粒廓清試驗(yàn)、血清溶血素試驗(yàn)、綿羊紅細(xì)胞(SRBC)誘導(dǎo)DTH試驗(yàn)分別對(duì)山藥多糖的非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究。1.4.1免疫臟器指數(shù)連續(xù)灌胃3周,末次灌胃第2天對(duì)小鼠稱重,摘眼球放血處死,剝?nèi)∑⑴K,將周圍組織剝離干凈后稱重,免疫臟器指數(shù)按下式計(jì)算。脾臟指數(shù)(mg/10g)=脾臟質(zhì)量(mg)/體重(10g)1.4.2小鼠體內(nèi)碳廓清能力檢測(cè)連續(xù)灌胃3周,末次給藥30min后,小鼠尾靜脈注射印度墨汁(生理鹽水稀釋4倍,0.1mL/10gbw)。注射墨汁立即計(jì)時(shí),1、5min分別從小鼠的眼靜脈叢取血20μL,立即將其加到2mL0.1%Na2CO3溶液中,搖勻,在波長680nm處測(cè)定吸光值,以0.1%Na2CO3溶液作空白。將小鼠頸椎脫臼處死,取肝臟和脾臟,用濾紙吸干臟器表面血污,分別稱重。按下式計(jì)算。式中:K為吞噬速率或廓清指數(shù);吞噬指數(shù)α為碳廓清能力;A1、A2為在時(shí)間為t1、t2時(shí)所取血樣的吸光值;t2-t1為取兩血樣的時(shí)間差。1.4.3液免疫后大鼠srbc的檢測(cè)足跖增厚法:在灌胃第3周,每只小鼠腹腔注射0.2mL2%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)。免疫后4d,用游標(biāo)卡尺測(cè)量左后足跖部厚度,然后于測(cè)量部位皮下注射20%SRBC,每只鼠注射20μL。注射后于24、48h分別測(cè)量左后足跖部厚度,同一部位測(cè)量3次。1.4.4srbc的體外免疫用SRBC免疫后,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗SRBC抗體(溶血素IgM),與SRBC一起孵育,在補(bǔ)體參與下,可產(chǎn)生溶血反應(yīng),釋放血紅蛋白,血紅蛋白含量反映了動(dòng)物血清中溶血素的含量。連續(xù)灌胃3周后,每只小鼠腹腔注射0.2mL20%SRBC進(jìn)行免疫,4d后,摘除眼球取血,2000r/min離心10min,收集血清,用生理鹽水500倍稀釋,吸取lmL于試管,依次加入0.5mL10%SRBC,1mL補(bǔ)體(生理鹽水1∶10稀釋);用生理鹽水代替血清作空白對(duì)照,37℃保溫10min,冰浴終止反應(yīng)。2000r/min離心10min,取上清液1mL加3mL都氏試劑(1.0gNaHCO3、0.05g氰化鉀、0.2g高鐵氰化鉀加蒸餾水溶解并定容至1000mL)于試管內(nèi),同時(shí)取0.25mL10%SRBC用都氏試劑稀釋至4mL于另一支試管中(用于測(cè)定SRBC半數(shù)溶血吸光值),各試管混勻后靜置10min,于540nm測(cè)吸光度值。按下式計(jì)算半數(shù)溶血值(HC50)。1.4.5數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析,各組間比較采用單因素方差分析。2結(jié)果與分析2.1樣品的吸光度測(cè)定一般情況下,物質(zhì)的還原能力越強(qiáng),抗氧化活性也越高。樣品反應(yīng)后的生成物在700nm處的吸光度值越大則樣品的還原能力越強(qiáng)。如圖1所示,山藥汁液多糖在2mg/mL的濃度范圍內(nèi),還原力隨著濃度的升高呈穩(wěn)定的增加趨勢(shì),表明其具有一定的還原力。2.2dpph清除率圖2可見,隨著濃度增加清除率逐漸上升,當(dāng)質(zhì)量濃度8mg/mL時(shí)對(duì)DPPH·清除率達(dá)到92.73%,此后維持在穩(wěn)定水平,表明山藥多糖對(duì)DPPH·有良好的清除能力。2.3多糖濃度對(duì)oh清除率的影響如圖3所示,山藥汁液多糖對(duì)·OH有良好的清除能力。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),隨著多糖濃度的增加,對(duì)·OH清除率不斷增強(qiáng)。當(dāng)濃度達(dá)到4mg/mL時(shí),對(duì)·OH清除率達(dá)到84.72%。2.4清除o2-能力鄰苯三酚在堿性條件下迅速氧化產(chǎn)生O2·-和有色中間產(chǎn)物,產(chǎn)生的O2·-能加速鄰苯三酚氧化速率和有色中間產(chǎn)物的生成;有色中間產(chǎn)物在322nm處有強(qiáng)烈的光吸收;加入抗氧化物質(zhì)可以清除O2·,從而能抑制鄰苯三酚的自氧化反應(yīng),阻止有色中間產(chǎn)物的積累;所以在322nm處比色,可以評(píng)價(jià)樣品清除O2·-的能力。如圖4所示,鄰苯三酚自氧化體系吸光值與反應(yīng)時(shí)間呈線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.9966,計(jì)算斜率得知鄰苯三酚自氧化速率V0為0.0477。由圖5可知,在所試濃度范圍內(nèi),山藥多糖對(duì)O2·-的清除率隨著濃度的增大而增加。但對(duì)O2·-的清除能力需要較高的濃度,當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為20mg/mL時(shí),對(duì)O2·-的清除率方可達(dá)到89.14%。2.5對(duì)脾臟指數(shù)的影響如表1所示,各劑量組相對(duì)空白對(duì)照組小鼠脾臟均有一定的增重效果。與空白對(duì)照組相比,隨著劑量的增加脾臟指數(shù)呈增加趨勢(shì)。高、中劑量組脾臟指數(shù)極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)。免疫器官是免疫細(xì)胞發(fā)生和增殖的場(chǎng)所,機(jī)體免疫力的強(qiáng)弱取決于免疫器官的狀況,脾臟是機(jī)體最大的免疫器官,是B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞定居的場(chǎng)所,本研究結(jié)果表明山藥多糖能顯著促進(jìn)免疫器官的發(fā)育,從而可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力。2.6兩組患者碳粒廓清指數(shù)和咀嚼指數(shù)的比較吞噬細(xì)胞的吞噬能力是構(gòu)成非特異性免疫的要素之一,吞噬細(xì)胞也是一類主要的抗原呈遞細(xì)胞,在特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,校正吞噬指數(shù)可反映吞噬能力的強(qiáng)弱和非特異性免疫功能的變化。如表2所示,與空白對(duì)照組相比,碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)隨著劑量的增大均有升高趨勢(shì)。對(duì)于吞噬指數(shù),中劑量組和高劑量組與空白對(duì)照組相比,差異均極顯著;對(duì)于廓清指數(shù),中劑量組顯著提高,高劑量組極顯著提高。2.7各組小鼠足跖厚度的變化各組小鼠由SRBC誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH),24h和48h足跖厚度的測(cè)量值如表3所示,隨著劑量的增加和時(shí)間的延長小鼠的足跖厚度均呈增厚趨勢(shì),與對(duì)照組相比,低中劑量組增厚不顯著,但高劑量組極顯著增厚(P<0.01)。2.8灌胃對(duì)小鼠血清中hc50的影響在體外,抗SRBC抗體與SRBC特異性結(jié)合,在補(bǔ)體的參與下導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解,發(fā)生溶血,所釋放的血紅蛋白量可反映抗體的生成量,在一定程度上反映了機(jī)體體液免疫功能的強(qiáng)弱。半數(shù)溶血值(HC50)越大,血清中的溶血素含量就越高。經(jīng)測(cè)定和計(jì)算,各組小鼠的HC50值分別為58.168±6.958(空白對(duì)照組)、64.158±6.012(低劑量組)、68.021±8.325*(中劑量組)、75.036±6.518**(高劑量組)?？梢?隨著灌胃劑量的增大,HC50也逐漸加大,呈劑量效應(yīng)。與對(duì)照組相比,中劑量組顯著增大(P<0.05),高劑量組極顯著增大(P<0.01)。3討論3.1抑制脂質(zhì)過氧化的抗氧化對(duì)其抗氧化能力的各種指標(biāo)進(jìn)行比較,還原-力最強(qiáng),對(duì)·OH和對(duì)DPPH·的清除能力次之,對(duì)O2·的清除能力最弱。自由基的氧化損傷與許多疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān),人體通過適當(dāng)攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以降低體內(nèi)自由基水平,防止脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化與衰老密切相關(guān),甚至誘發(fā)許多疾病。尋找能抑制脂質(zhì)過氧化的抗氧化劑一直是營養(yǎng)生物化學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。BHA、BHT等化學(xué)合成物抗氧化效果雖好,但對(duì)人體肝、脾、肺有害,具有蓄積性致癌作用。本研究利用化學(xué)模型表明山藥多糖具有較強(qiáng)的抗氧化作用,為以后安全有效、具營養(yǎng)作用、天然抗氧化劑的開發(fā)提供了新資源。3.2對(duì)b細(xì)胞增殖和分化的作用山藥多糖可顯著提高正常小鼠外周血中吞噬細(xì)胞清除碳顆粒的能力,因而具有增強(qiáng)非特異性免疫的功能。其機(jī)理可能是山藥多糖中的某些成分作為一種免疫激活劑,激活大量處于靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞,同時(shí)又顯著提高了已經(jīng)處于活化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞的吞噬功能。山藥多糖對(duì)體液免疫的正調(diào)節(jié)作用,是由于提高了漿細(xì)胞分泌特異性抗體的能力,還是促進(jìn)了B淋巴細(xì)胞增殖和分化的能力,還有待進(jìn)一步研究。山藥多糖也能明顯促進(jìn)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生,說明其具有促進(jìn)細(xì)胞免疫的功能?？梢?山藥多糖可促進(jìn)免疫器官的發(fā)育,有效促進(jìn)機(jī)體的非特異性免疫、體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答能力,并表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng),因而可促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。3.3乳液蛋白的提取與功能本研究山藥汁液干粉是山藥提取淀粉時(shí)分離的汁液經(jīng)噴霧干燥而得,其主要成分是山藥的水溶性物質(zhì),經(jīng)測(cè)定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.6%、黏液蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.2%,因此對(duì)山藥汁液干粉中黏液蛋白的提取與功能性研究也很重要,這些研究對(duì)山藥汁液干粉的開發(fā)