核酸血液篩查課件

核酸血液篩查P1126October2023分子生物學概論—核酸血液篩查相關技術二三目

錄核酸血液篩查系統(tǒng)26October2023四血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存三P22PCR實驗室的污染防治分子生物學概論26October2023核酸的分子組成-核苷酸P33分子生物學概論26October2023DNA的一級結(jié)構(gòu)CytosineAdenineThymineGuanineHydrogen

BondsDeoxyribose(Sugar

molecule)Phosphoric

Acid(Phosphate

molecule)由A/T/G/C四種單核苷酸組成P44分子生物學概論26October2023DNA的二級結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子由相互平行、走向相反、堿基互補

的兩條脫氧核糖核苷

酸鏈圍繞同一中心軸，盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)，

螺旋的一側(cè)為大溝，

另一側(cè)為小溝。平行鏈對應堿基總是A==T、G===C配對（basepairing)或互補，形成穩(wěn)定聯(lián)系。P5526October2023分子生物學概論核酸的理化性質(zhì)DNA的熱變性與復性慢驟DNA熱變性后緩慢冷卻處理過程稱退火annealingDNA加熱變性后，若經(jīng)驟然降溫，互補鏈堿基之間來不及配對互補，形成氫鍵聯(lián)系，兩鏈維持分離狀態(tài)。P66分子生物學概論26October2023核酸分子雜交

hybridization當不同來源的核酸變性后一起復性時，只要這些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成堿基配對，出現(xiàn)復性現(xiàn)象，形成雜種核酸分子，或稱雜化雙鏈，稱核酸分子雜交。P77分子生物學概論26October2023DNA半保留復制DNA合成進行時，以兩條親代DNA鏈中的每—條鏈為模板，在DNA指導下的DNA聚合酶催化下，按A與T、G與C堿基配對原則合成子代DNA的過程稱

DNA的復制(replication)。由于復制合成的子代DNA兩條脫氧核糖核苷酸鏈中有一條來自親代DNA，另一條是以前者為模板新合成的子代DNA鏈，所以DNA的這種合成作用又稱半保留復制(semiconservative

replication)。P88核酸血液篩查相關技術26October2023核酸血液篩查相關技術磁珠法提取核酸熒光PCR技術與TMA技術UNG-dUTP防污染系統(tǒng)內(nèi)對照分子P99核酸血液篩查相關技術26October2023磁珠法提取核酸樣品核酸提取磁珠法P1010核酸血液篩查相關技術26October2023磁珠法提取核酸第一步：細胞的裂解：破碎細胞，并向溶液

中加入磁珠。P1111第二步：結(jié)合核酸：pH較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合核酸血液篩查相關技術26October2023磁珠法提取核酸第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離（為清洗干凈該步驟可以重復多次）。P1212第四步：核酸的洗脫：

pH升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來。核酸血液篩查相關技術26October2023PCR技術3’5’5’3’d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’加入試管中P1313核酸血液篩查相關技術26October2023PCR技術5’3’5’3’5’3’5’3’繼續(xù)延伸5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循環(huán)P1414核酸血液篩查相關技術26October2023PCR技術3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’第二個循環(huán)

4個拷貝第三個循環(huán)

8個拷貝5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’第n個循環(huán)

2n個拷貝P1515核酸血液篩查相關技術26October2023PCR技術P1616分子生物學概論26October2023TMA技術P1717核酸血液篩查相關技術P181826October2023TMA與PCR比較TMAPCR擴增原理模擬自然DNA

轉(zhuǎn)錄成mRNA

的過程模擬自然DNA復制的過程靶目標RNADNA酶MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7

RNA聚合酶DNA聚合酶反應體系兩種酶，兩條引物，dNTP,NTP一種酶，一對引物，dNTP溫度條件恒溫（41.5℃）循環(huán)導熱（變性，退火，延伸）擴增儀器水浴箱或者加熱塊熱循環(huán)儀擴增產(chǎn)物RNADNA擴增速度每個循環(huán)可以生成100-1000個復制物，在15-30分鐘內(nèi)可增加10億倍復制物以2n擴增，2～3

h就能將待擴目的基因擴增放大10億倍核酸血液篩查相關技術26October2023熒光PCR技術SYBR

GREENP1919Molecularbeacon核酸血液篩查相關技術26October2023TaqMan熒光PCR技術P2020核酸血液篩查相關技術P2126October2023TaqMan熒光PCR技術3’5’5’3’d.NTPsThermal

StableDNA

PolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Add

Master

Mixand

SampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReaction

TubeTaqλR5’Q3’ProbeR5’Q3’21核酸血液篩查相關技術26October20235’3’5’3’Extension

Step5’3’1.

Strand

DisplacementTaqQ3’5’RR5’3’Q3’TaqR5’2.

Cleavage3.

PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’5’3’QTaqR3’

4.

Detection5’λ5’TaqMan熒光PCR技術RQ3’P2222核酸血液篩查相關技術26October2023熒光定量PCR技術一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段

, 熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。P2323核酸血液篩查相關技術26October2023CT值與閾值CT值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)。P2424核酸血液篩查相關技術26October2023CT值與閾值實驗操作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計學上顯著的熒光發(fā)射時所對應的PCR循環(huán)次數(shù)（圖）?！盎€上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號強度標準偏差的

10倍。閾值所在的橫線與

PCR擴增曲線的交點所指的

PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值。P2525核酸血液篩查相關技術26October2023熒光定量PCR檢測流程圖P2626核酸血液篩查相關技術26October2023UNG-dUTP防污染系統(tǒng)UNG：Uracil-DNA

Glycosylase，也稱為UDG，尿嘧啶糖基化酶UUUU50℃,2minUNGP2727核酸血液篩查相關技術26October2023UNG生化特性1P2828234無作用：游離U、A、T、G、C和RNA不耐熱：

37-50℃95℃分子量小球蛋白

發(fā)揮作用不依賴于

Mg2+作用范圍：單鏈和雙鏈

U堿基糖苷鍵核酸血液篩查相關技術26October2023產(chǎn)物污染交叉污染試劑污染天然核酸的污染dUTP-UNG系統(tǒng)實施的必要性實驗室污染P2929物理分區(qū)紫外線照射高壓消毒4.10%次氯酸鈉DNase

I消化UNG消化核酸血液篩查相關技術26October2023dUTP-UNG作用原理切割下來，形成自由的尿嘧啶和“糖-磷酸”骨架加熱或堿性條件下，DNA在“糖-磷酸骨架”處斷裂模板無法擴增dUTP代替dTTP擴增，形成UNG有效作用底物U-DNA特異地識別DNA分子中尿嘧啶核苷P3030核酸血液篩查相關技術26October2023dUTP-UNG作用示意圖P3131核酸血液篩查相關技術26October2023dUTP-UNG優(yōu)缺點缺點優(yōu)點防止含dU產(chǎn)物的污染不影響目的片段的擴增作用條件簡單，易實現(xiàn)。只防自身產(chǎn)物的污染，不 防天然產(chǎn)物的污染。若混有核酸酶，會同時分解目的產(chǎn)物。UNG致使CT值增加，易導致假陰性。dUTP在對GC豐富的模板時作用不大。滅活不夠完全。相對用dTTP，成本高。P3232核酸血液篩查相關技術P333326October2023內(nèi)對照分子內(nèi)參照的概念人工合成的小片段DNA，放在反應液中和待測目的基因一起擴增。內(nèi)對照是PCR方法檢測疾病基因的必需成分，是防止假陰性、提高檢測結(jié)果可靠性的重要標示。內(nèi)對照對整個實驗流程，包括樣品提取、分裝、PCR熱循環(huán)儀孔間差、PCR抑制元素等等可能的影響因素進行監(jiān)控，防止假陰性，提高安全性核酸血液篩查相關技術26October2023競爭性內(nèi)對照分子兩端為特異性引物目的基因片段內(nèi)對照順序競爭性內(nèi)對照的概念–與目的基因使用相同的引物。–擴增產(chǎn)物序列與目的基因不同，可用不同的探針檢測。P3434核酸血液篩查相關技術26October2023非競爭性內(nèi)對照的概念–與目的基因使用不同的引物。–擴增產(chǎn)物序列與目的基因不同，可用不同的探針檢測。競爭性內(nèi)對照分子目的基因特異性引物內(nèi)對照特異性引物

目的基因片段內(nèi)對照順序P3535核酸血液篩查相關技術P363626October2023內(nèi)對照分子內(nèi)對照的作用真實反應擴增效率避免假陰性：假陰性是目前血液篩查中最重視的問題之一，內(nèi)標全程進行質(zhì)量監(jiān)控質(zhì)控血篩核酸檢測的內(nèi)對照設計理念中心理念：監(jiān)測全程的實驗過程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、及擴增過程的效率。內(nèi)對照選用：最好能達到上述三個條件，且能顧及仿真病毒的安全性。核酸血液篩查系統(tǒng)26October2023核酸血液篩查系統(tǒng)核酸檢測樣本匯集設備自動化核酸提取設備PCR擴增和擴增產(chǎn)物的檢測設備P3737核酸血液篩查系統(tǒng)26October2023核酸血液篩查系統(tǒng)分析后采集容器采集方式保存運輸不合格樣本：脂血、溶血、樣本量不足樣本分析中分析前檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果儀器維護自檢準備：質(zhì)控

樣本

試劑前處理混樣信息錄入擴增檢測核酸純化純化試劑 檢測試劑的準備

準備試劑`設備

質(zhì)控品P3838核酸血液篩查系統(tǒng)26October2023核酸檢測樣本匯集設備加樣器P3939HAMILTON

液體工作站核酸血液篩查系統(tǒng)26October2023自動化核酸提取設備自動化核酸提取(EZbead

system-32)P4040核酸血液篩查系統(tǒng)26October2023PCR擴增和擴增產(chǎn)物的檢測設備ABI7500實時熒光定量PCR儀P4141血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存26October2023血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存樣本的采集樣本的運送樣本的接收與保存P4242血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存26October2023關注采集、保存、運輸?shù)募毠?jié)運輸條件離心P4343采血管26October2023標本的采集-采血管無菌真空采血管一、血清管普通血清管帶分離膠的血清管二、抗凝管EDTA 2K或3K抗凝管EDTA

2K抗凝間分離膠（PPT)枸櫞酸鈉抗凝管P4444血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存26October2023P4545標本的采集-離心離心條件800-1600g

20min離心分離的時間要求—HCV

RNA和HIV

RNA研究方式不同（樣本、檢測）結(jié)論差異大離心時間完成地點血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存26October2023標本的運送2-8°C穩(wěn)定48hr血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存P464626October2023P4747標本的接收、保存確認標本數(shù)量運輸狀態(tài)標本狀態(tài)：溶血、脂血保存：用于檢測的樣本管：檢測前保存用于留樣備查的樣本：樣本量血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存26October2023P4848檢測前核對狀態(tài)標識接收時間離心后至檢測前2-8°C保存不超過48小時血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存26October2023P4949長期留樣樣本理論上-80°C保存量：核酸檢測樣本量比酶免確認實驗大長期保存：保存管密閉程度血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存PCR實驗室污染防治26October2023PCR實驗室污染防治PCR實驗室的分區(qū)實驗室人員基本要求PCR實驗室管理核酸擴增儀器設備的質(zhì)控P5050PCR實驗室污染防治P515126October2023PCR實驗室的分區(qū)一個基本符合要求的PCR實驗室應包括3~4個區(qū)試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)各區(qū)在物理空間上完全互相獨立，使用功能上互相分割各區(qū)之間不能有空氣直接相通各區(qū)使用的儀器設備、移液器、Tip、試管架、筆記本、記號筆、手套等包括清潔用物品都必需執(zhí)行專區(qū)專用原則。PCR實驗室的污染防治26October2023理想的核酸擴增實驗室設計A產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)P5252標本制備區(qū)試劑準備區(qū)PCR實驗室的污染防治26October2023理想的核酸擴增實驗室設計B產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)P5353標本制備區(qū)試劑準備區(qū)26October2023P5454PCR實驗室的污染