沙門氏菌檢驗(yàn)

第三章食品中腸道致病菌檢驗(yàn)

第一節(jié)沙門氏菌檢驗(yàn)第二節(jié)志賀氏菌檢驗(yàn)第三節(jié)致瀉性大腸埃希氏菌檢驗(yàn)第四節(jié)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢驗(yàn)第五節(jié)副溶血性弧菌檢驗(yàn)第六節(jié)空腸彎曲菌檢驗(yàn)1中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Salmonella中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布2016-12-26發(fā)布2017-06-23

實(shí)施2

第一節(jié)沙門氏菌檢驗(yàn)

ExaminationofSalmonella第一部分：沙門氏菌概述1、沙門氏菌致病性2、生物學(xué)特性第二部分：GB/T4789.4-20103、設(shè)備和材料（略）4、試劑和培養(yǎng)基5、檢驗(yàn)步驟和原理6、快速檢測(cè)3第一部分：沙門氏菌概述(IntroductionofSalmonella)1、致病性：

菌型多-2500多血清型；易感動(dòng)物種類多，幾乎各種動(dòng)物都有沙?。徊》N多：菌型和動(dòng)物不同，病不同，同種動(dòng)物可以得多種沙病，如雞。主要幼齡動(dòng)物和小孩易感染。雞白痢

eggsandsalmonella4

世界上最大的一起沙門氏菌食物中毒是1953年于瑞典，由吃豬肉而引起的鼠傷寒沙門氏菌中毒，7717人中毒，90人死亡。美國2010.1爆發(fā)沙門氏菌疫情，共有474人染病，造成6人死亡，當(dāng)局懷疑與受污染的花生醬食品有關(guān)。英國官方機(jī)構(gòu)2012.2.4發(fā)布，英國出現(xiàn)沙門氏菌疫情(紐波特沙門菌)，已致30多人感染，其中一人死亡。目前初步懷疑傳染源是受病菌污染的西瓜，相關(guān)機(jī)構(gòu)提醒民眾注意飲食衛(wèi)生。5簡(jiǎn)單介紹沙門氏菌引起的食物中毒

（1）沙門氏菌引起食物中毒的癥狀（2）中毒沙門氏菌的來源（3）沙門氏菌引起食物中毒條件（4）沙門氏菌引起食物中毒的致病機(jī)理(5)引起食物中毒沙門氏菌的主要血清型.hk/.../images/salmonella_ec.jpg6（1）食物中毒癥狀：五種類型

胃腸炎型類傷寒型類霍亂型類感冒型敗血癥型在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌食物中毒常占首位或第二位

72004年Foodnet監(jiān)控的感染性疾病實(shí)驗(yàn)室診斷15806病例中各傳染性病原的種類8（2）中毒菌來源

沙門氏桿菌來源于人和動(dòng)物的糞便

－－活體本身感染帶菌－－胴體及產(chǎn)品污染帶菌；

菌體主要通過動(dòng)物性食品及其制品如肉、禽、蛋、奶、水產(chǎn)品及其制品引起食物中毒；

*大塊食品內(nèi)部菌和毒素未被殺死和破壞，食入后中毒；*菌體較少，但在是適宜條件下放置較久，菌體在食物中大量繁殖，食前未加熱或加熱不足。*加熱不徹底，有殘留菌，又放置時(shí)間較長。*直接進(jìn)食的食物被二次污染

9（3）食物中毒條件

菌體：菌型、毒力、數(shù)量:活菌體數(shù)量，數(shù)量越多，發(fā)病幾率越高,一般為2×105～1×108

cfu/g。機(jī)體：抵抗力，兒童、老人、體弱者和患其他病的人。10（4）致病機(jī)理：

*活細(xì)菌對(duì)腸粘膜的侵襲*腸毒素毒害作用www.idph.state.il.us/public/hb/hbsam.htm(5)引起食物中毒的主要沙門氏菌有：

傷寒沙門氏菌

(S.typhimurium)副傷寒沙門氏菌(S.paratyphi)

鼠傷寒沙門氏菌

(S.typhimurium)腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)主要通過污染的水傳播主要通過污染的食物傳播12Salmonellaisoneofthemostprevalentpathogensassociatedwithfoodborneillness.Itisthecauseofanestimated14millionillnessesannuallyinUSAalone(Lynchetal.2006).Inrecentdecades,proportionofsalmonellosisattributedtoSalmonellaentericasubspeciesentericaserovarEnteritidis(SalmonellaEnteritidis),relativetootherSalmonellaserovars,hasincreased.

Accordingtoa2001report(Guard-Petter2001),Enteritidisisthemostprevalentserovarimplicatedinverifiedcasesofsalmonellosisworldwide.ThemostcommonfoodsourceofEnteritidisiseggs.13Shelleggsarecommonlycontaminatedinaverticalmannerduringeggformationincolonizedhenoviduct,orhorizontallyviamigrationofsalmonellaethroughtheeggshellaftercontactwithcontaminatedsubstancessuchashenfaeces(Guard-Petter2001;CentersforDiseaseControlandPrevention(CDC)2003;Grijspeerdtetal.2005;Lynchetal.2006).

Internallycontaminatedeggs,obtainedfromnaturallyinfectedhens,maycontain≤10Salm.Enteritidispereggandthepathogenismostlikelylocalizedoutsidethevitellinemembraneorinthealbumensurroundingit(Humphrey1994;Humphreyetal.1991;Poppeetal.1992).Consumptionofeggsthatareraworundercookedandpoolingofeggs(acommonpracticeinrestaurantsandinstitutionalsettings)canincreaseriskofillness(CentersforDiseaseControlandPrevention(CDC)2003;Lynchetal.2006).142、沙門氏菌的生物學(xué)特性

*2.1形態(tài)與染色*2.2培養(yǎng)特性*2.3生化特性*2.4抗原構(gòu)造與分類*2.5抗原變異*2.6抵抗力

152.1形態(tài)與染色

沙門氏菌是G-，無芽孢，周生鞭毛的短桿菌，但也有無動(dòng)力的變種。

162.2培養(yǎng)特性

對(duì)營養(yǎng)要求不高，在營養(yǎng)瓊脂上，一般條件下培養(yǎng)24h形成S型菌落。

17葡萄糖＋靛基質(zhì)-乳糖－/×H2S+/-蔗糖-尿素酶-麥芽糖+明膠液化d甘露糖+在KCN中生長-山梨糖+苯丙氨酸脫氨酶-衛(wèi)矛醇d丙二酸鈉-/+水楊苷-賴氨酸脫羧酶+甲基紅+精氨酸脫羧酶+/(+)V-P-鳥氨酸脫羧酶+沙門氏菌雖然近3000多個(gè)血清型，但絕大多數(shù)血清型的細(xì)菌生化特性非常一致。因此，生化特性對(duì)沙門氏菌的鑒定具有重要意義。2.3生化特性+陽性，（＋）遲緩陽性，×遲緩不規(guī)則陽性或陰性，－陰性，d有不同的生化型2.3生化特性根據(jù)生化特性，沙門氏菌屬分為6個(gè)亞屬，其中亞屬I是生化特性典型的沙門氏菌，是常見的沙門氏菌。列舉與檢驗(yàn)有關(guān)的重要生化特性及與埃希氏菌屬的區(qū)別項(xiàng)目沙門氏菌屬（亞屬I、II、IV、V、VI）亞利桑那屬（亞屬III）埃希氏菌屬硫化氫＋91.6%＋98.7%-0乳糖-0.8%d61.3%+90.8%蔗糖-0.5%-4.7%d48.9%水苷-0.8%-4.7%d40.0%表沙門氏菌的重要生化特性及與埃希氏菌屬的區(qū)別注：表中數(shù)字為陰性百分率；＋表示陽性；-表示陰性；d表示有不同的生化反應(yīng)192.4抗原構(gòu)造與分類（先看大書p5－6表）

沙門氏菌的抗原主要有三類：

*菌體抗原(O抗原)*鞭毛抗原(H抗原)*表面抗原(Vi抗原)

20(1)菌體抗原(O抗原)

存在于細(xì)胞壁最外層的多糖-類脂-蛋白質(zhì)復(fù)合物，多糖部分決定O抗原的特異性，加熱至100℃經(jīng)2.5h不能被破壞，也不能被乙醇及0.1％石炭酸破壞。O抗原有許多不同的組成成分，用阿拉伯?dāng)?shù)字1，2，3，4，…，67表示，觀已排到67位，但實(shí)際只有58種。

主要抗原：一種菌可含多種O抗原，其中一群細(xì)菌獨(dú)有的，其他細(xì)菌則沒有的。具相同O抗原的菌歸為一個(gè)血清群，將整個(gè)沙門氏菌屬分為42個(gè)群，A-Z和O51-O67表示,其中95%致病菌在A-F群中次要抗原：一些抗原是在兩群或幾群細(xì)菌所共有的。如1，5，12。21O群O抗原O群O抗原O群O抗原A1,2,12B1,4,5,121,4,12,27C16,7C26,8C38,20C46,7,14D11,9,12D29,46E23,10E33,5,34E41,3,19F11G11,13,22G21,13,23H1,6,14,241,6,14,25IJKLMNOPQRSTUVWXYZ1617182128303538391,40411,424344451,474850

其他O群1，1552535455565758596061626364656667沙門氏菌屬O抗原表22(2)鞭毛（H）抗原－－分型依據(jù)

是存在于鞭毛上的不耐熱蛋白質(zhì)。沙門氏菌的H抗原有兩種：

第1相(特異相)小寫英文字母表示：a，b，c，…，z，z1，z2，

第2相(非特異相)，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示：l，2，3，但少數(shù)也有用英文字母表示的，如l和w?？磿鳳5－6的表

雙相菌：具有兩相H抗原的沙門氏菌稱雙相菌。大多數(shù)；

單相菌：只有一相H抗原的沙門氏菌稱單相菌。少數(shù)。

每群(組)沙門氏菌根據(jù)H抗原不同分成不同菌型。23(3)Vi抗原：極少數(shù)沙門氏菌有.

極少數(shù)沙門氏菌含有Vi抗原，如傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌，Vi抗原是菌體表面莢膜多糖抗原，可阻止O抗原與O抗體的特異性凝集反應(yīng)，Vi抗原不耐熱，加熱酒精燈加熱煮沸100℃經(jīng)5min/60℃30min即可破壞。血清型鑒定0抗原與O抗體的特異性凝集反應(yīng)，如不凝集，須加熱100℃5min后破壞Vi抗原，菌體抗原才能與O抗血清發(fā)生凝固。242.5抗原的變異

(1)H抗原的位相變異(2)菌落的S—R變異

(1)H抗原的位相變異

沙門氏菌第1相H抗原和第2相H抗原發(fā)生分離或位相變異第1相H抗原可以在第2相中發(fā)生，第2相H抗原也可以在第1相中發(fā)生的現(xiàn)象叫位相變異。如乙型副傷寒沙門氏菌的抗原式為b，1，2。如果我們挑取乙型副傷寒沙門氏菌在平板上劃線分離培養(yǎng)，長出許多菌落，則一部分菌落只有第1相b，而另一部分菌落只有第2相1和2；

Hb，1，2b1，2分離培養(yǎng)分離位相變異25(2)菌落的S—R變異

沙門氏菌在人工培養(yǎng)基上經(jīng)過多次傳代，菌落由光滑型變?yōu)榇植谛停?抗原也隨之消失，這樣的菌株則不能用凝集試驗(yàn)分型檢驗(yàn)。

26分類總結(jié)：生化特性不同分

6個(gè)亞屬，Ⅰ－Ⅵ亞屬菌體抗原(O抗原)，用阿拉伯?dāng)?shù)字1，2，3，4，···67（58），

具有相同O抗原的為一群，A.B.······Z,Z之后用O加下腳阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如A群.B群.O1群、O2群、O3群等,其中95%致病菌在A,B,C,D,E,F六個(gè)群中。H抗原－－分型依據(jù)：

第一相(特異相)a，b，c，…，z，z1，z2，表示；第二相(非特異相)，l，2，3表示。按O抗原和鞭毛H抗原的不同，將沙門氏菌分為近2500個(gè)血清型27分類：

*腸桿菌科（Enterobacteriaceae）沙門氏菌屬（Salmonella）

生化特性分為6個(gè)亞屬

O抗原有58種,相同O抗原歸為一群/組

按O抗原和鞭毛H抗原約分2500個(gè)血清型282.6抵抗力

沙門氏菌對(duì)熱及外界環(huán)境的抵抗力屬于中等；沙門氏菌對(duì)化學(xué)藥品的抵抗力較弱；

膽鹽、煌綠及孔雀綠等對(duì)本菌的抑制作用弱于大腸桿菌，?？捎靡灾苽溥x擇性培養(yǎng)基；沙門氏菌屬細(xì)菌對(duì)氯霉素敏感。29GB/T4789.4—2016代替GB/T4789.4—2010GB/T4789.4—2008食品安全國家檢驗(yàn)食品微生物檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)NationalfoodsafetystandardFoodMicrobiologicalexamination:Salmonella第二部分：GB/T4789.4-201630前言本標(biāo)準(zhǔn)參考采用了國際分析家學(xué)會(huì)（AOACINTER－NATIONAL）AOACOfficialMethod967.26，967.27，967.28；國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）ISO6579：2002；美國食品藥品管理局（FDA）《細(xì)菌分析手冊(cè)》第5章：沙門氏菌（2003年）（BacteriologicalAnalyticalManual,Chapter5:Salmonella,2003）。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.4—2010/2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》。本標(biāo)準(zhǔn)自實(shí)施之日起，GB/T4789.4—2010同時(shí)廢止。31本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.4—2010相比主要變化如下：——修改了檢測(cè)流程和血清學(xué)檢測(cè)操作程序；——修改了附錄A和附錄B；

本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.4-2008相比，主要變化如下：——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；——修改了標(biāo)準(zhǔn)的范圍；——修改了培養(yǎng)基和試劑；——修改了設(shè)備和材料；——修改了附錄A。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國衛(wèi)生部提出并歸口。321規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)。

332設(shè)備和材料

（新改的有，原有的部分略）2.4振蕩器。2.5電子天平：感量（原來叫精確至）0.1g。2.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。2.11pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。2.12全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)343培養(yǎng)基和試劑

3.1緩沖蛋白胨水（BPW）：見第A.1章。

3.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：見第A.2章。3.3亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液：見第A.3章。

3.4

亞硫酸鉍瓊脂(BS)瓊脂；3.5HE（HektoenEnteric）瓊脂（含乳糖和蔗糖）3.6木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂：見第A.6章。3.7沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)3.8三糖鐵（TSI）瓊脂：見附錄A中A.73.9蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑：見附錄A中A.83.10尿素瓊脂（pH7.2）：見附錄A中A.93.11氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基：見附錄A中A.103.12賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：見附錄A中A.113.13糖發(fā)酵管：見附錄A中A.123.14鄰硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培養(yǎng)基：見附錄A中A.133.15半固體瓊脂：見附錄A中A.143.16丙二酸培養(yǎng)基：見附錄A中A.153.17沙門氏菌O和H診斷血清3.18生化鑒定試劑盒增菌液選擇性平板生化試驗(yàn)管血清學(xué)實(shí)驗(yàn)35前增菌：用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌恢復(fù)活力；BPW選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢(shì)增殖，其它細(xì)菌受到抑制；選擇性平板分離培養(yǎng)：BS+XLD/HE/沙氏顯色培養(yǎng)基生化試驗(yàn)：鑒定分離出的細(xì)菌是否符合沙門氏菌的生化譜，可采用API20E等成套生化試劑血清學(xué)鑒定：特異性診斷血清鑒定到種4.GB/T4789.4-2016沙門氏菌檢驗(yàn)程序多價(jià)血清學(xué)鑒定血清學(xué)分型（選做）

樣品（20類）25g225mL乳糖肉湯（LB）or胰酪胨大豆肉湯（TSB）or煌綠溶液（BG）or通用前增菌肉湯（UPB）or營養(yǎng)肉湯（NB）or再造脫脂奶粉or四硫酸鹽煌綠（TT）pH6.8±0.224±2h35℃RVTT43±0.2℃or35±2.0℃24±2h24±2h42±0.2℃BS&XLD&HE24±2h35℃TSI&LIA非沙門菌沙門菌非沙門菌LIA+LIA－TSIK/ALIA－TSIA/A尿素酶，H抗原（多價(jià)H抗血清或Spicer-Edwardsflagellar(H)test），賴氨酸脫羧酶，酚紅衛(wèi)矛醇肉湯，色氨酸肉湯（KCN，丙二酸鹽，吲哚），O抗原酚紅乳糖肉湯，酚紅蔗糖肉湯，MR－VP,西蒙氏檸檬酸鹽（API20E,EnterotubeII,

EnterobacteriaceaeII,MICRO-ID,orVitekGNI）+O抗原&H抗原細(xì)菌學(xué)分析手冊(cè)（FDA/BAM）沙門菌屬肉、禽和蛋品中沙門菌的分離和鑒定USDA/FSISMLG4.02樣品BPWorBPW（含結(jié)晶紫）35±1℃20-24hBGS&DMLIAorXLT442±0.5℃22~24h0.5±0.05mL＋10mLTT0.1±0.02mL＋10mLmRV42±0.5℃22~24h35±1℃18~24h&48hTSI&LIA血清學(xué)試驗(yàn)商業(yè)生化試劑盒或自動(dòng)鑒定系統(tǒng)or傳統(tǒng)生化鑒定報(bào)告結(jié)果

4.1前增菌：特別是菌體受損嚴(yán)重的樣品4.2（選擇性）增菌

4.3分離4.4生化試驗(yàn)鑒定到屬：初步生化試驗(yàn)和進(jìn)一步生化試驗(yàn)4.5血清學(xué)分型鑒定（用1.2%－1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原）菌型判定和結(jié)果報(bào)告4.操作步驟和原理394.1前增菌步驟稱取25g（ml）樣品放入盛有225mlBPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000－10000r/min均質(zhì)1－2min，或置于盛有225mlBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊時(shí)均質(zhì)器拍打1－2min。若樣品為液態(tài)，需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需要，用1M無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。如用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36℃±1℃培養(yǎng)8～18h。

如為冷動(dòng)產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過15min，或2℃-5℃不超過18h解凍。

增加拍擊式均質(zhì)器，均質(zhì)袋可直接培養(yǎng)。目的－－復(fù)活、分離、增菌－－提高該菌檢出率40復(fù)活/前增菌：用不加任何抑菌劑，無選擇性的培養(yǎng)基－－緩沖蛋白胨水(BPW)進(jìn)行增菌，使處于瀕死狀態(tài)的沙門氏菌恢復(fù)活力；

*沙門氏菌屬最重要的病原菌，食品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不得含有*沙門氏菌在食品中的含量較少*食品加工過程使菌體損傷而處于瀕死的狀態(tài)414.2選擇性增菌試驗(yàn)步驟輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)接于10mLTTB內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18h-24h。同時(shí)，另取1mL，轉(zhuǎn)接于10mLSC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h。

AOAC：TT、SCFDA：RV、TTISO：RV、SC選擇性增菌的目最大可能的檢出沙門氏菌，原則上必須使用兩種選擇性分離增菌液：一種是抑制除沙門氏菌以外其腸道菌的生長，一種是在不影響其他腸道菌生長的情況下促進(jìn)沙門氏菌的生長。431）四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液-42℃膽鹽和煌綠是抑G＋菌；硫代硫酸鈉和碘反應(yīng)生成四硫磺酸鈉抑制大腸桿菌，沙菌有四硫磺酸酶，能解毒；碳酸鈣起穩(wěn)定硫代硫酸鈉的作用配方1）基礎(chǔ)液（900mL）蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化鈉3.0g碳酸鈣45.0g蒸餾水1000mL2）硫代硫酸鈉溶液（100mL）3）碘溶液（20mL）4）0.05%煌綠水溶液（2mL）5）牛膽鹽溶液（50mL）更適合于最適生長溫度42℃的傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌兩種以外的大多數(shù)沙門氏菌

44亞硒酸鹽與硫化物形成硒硫化合物可起到抑雜菌作用；胱氨酸可促進(jìn)沙門氏菌生長；2）亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液-36℃配方蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氫二鈉10.0g亞硒酸氫鈉4.0gL-胱氨酸0.01g蒸餾水1000mL更適合于傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌，最適生長溫度36℃45SC亞硒酸鹽胱氨酸增菌液TTB四硫磺酸鈉煌綠增菌液MM氯化鎂孔雀綠增菌液亞硒酸鹽抑菌胱氨酸促生長四硫磺酸鈉和煌綠抑菌氯化鎂和孔雀綠抑菌適合傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌生長，36℃適合其他沙門菌生長，42℃，18-24h，為防漏檢宜SC+TTB/MM表2常用選擇性培養(yǎng)基比較4.3平板分離

---抑制雜菌和選擇性鑒別培養(yǎng)基試驗(yàn)步驟分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種一個(gè)在亞硫酸鉍瓊脂BS及木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂XLD/HE/沙門氏菌顯色培養(yǎng)基劃線，分離培養(yǎng)FDA：BS、XLD、HEAOAC：BS、XLD、HEISO：phenolredbrilliantgreen瓊脂、BS或HE平板分離目的

為了最大可能的檢出沙門氏菌，選擇性鑒別平板上形成肉眼可見的典型菌落，原則上必須使用兩種以上選擇性分離培養(yǎng)基。47沙門氏菌在亞硫酸鉍瓊脂(BS瓊脂)上典型特征

菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變

亞硫酸鉍BS配方蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亞鐵0.3g磷酸氫二鈉4.0

g煌綠0.025g檸檬酸鉍銨2.0g亞硫酸鈉6.0g瓊脂20g蒸餾水1000mLpH7.548HE配方蛋白胨12.0g牛肉膏3.0g蔗糖12.0g乳糖12.0g水楊素2.0g膽鹽20.0

g氯化鈉5.0g瓊脂20g蒸餾水1000mL0.4%溴麝香草酚藍(lán)溶液

16mlAndrade指示劑20ml甲液20ml乙液20mlpH7.549沙門氏菌在HE瓊脂上典型特征藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色

沙門氏菌在XLD瓊脂上典型特征沙門氏菌在35℃培養(yǎng)24-48小時(shí)后，粉紅色/黃色菌落有或無黑色中心。

XLD配方酵母膏3.0gL-賴氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗糖7.5g去氧膽酸鈉2.5g檸檬酸鐵銨0.8g硫代硫酸鈉6.8gNaCl5.0g瓊脂20g酚紅0.08g蒸餾水1000mLpH7.550BBL?CHROMagar?SalmonellaMediumReceivesAOAC-RIApproval

5152I-SS65.3I-SS-M81.0C-SS52.0I-HE83.2C-HE80.0I-XLD83.0C-XLD86.2I-BS106.6C-BS77.7CHRO68.4C-DHL98.4C-WS71.6TSA（對(duì)照）100.0I：進(jìn)口C：國產(chǎn)53選擇性鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入的指示系統(tǒng)主要是使沙門氏菌和雜菌（經(jīng)選擇增菌，余下的主要是埃希氏菌屬）的菌落特征最大限度地區(qū)分開。

2個(gè)指示劑系統(tǒng)：乳糖指示系統(tǒng)

硫化氫指示系統(tǒng)54沙門氏菌：不分解乳糖，指示劑不變色，菌落不變色；埃希氏菌屬：分解乳糖產(chǎn)酸，指示劑變色，菌落變色。（1）乳糖指示系統(tǒng)根據(jù)沙門氏菌屬和埃希氏菌屬生化特性，在鑒別培養(yǎng)基中加入乳糖和酸堿指示劑作為乳糖指示系統(tǒng)。55（2）硫化氫指示系統(tǒng)

大部分沙門氏菌亞屬Ⅲ，即亞利桑那菌都能分解乳塘，這樣光靠乳糖指示系統(tǒng)不能將亞屬Ⅲ和埃希氏菌屬區(qū)別開來，因此，要將亞屬Ⅲ和埃希氏菌屬區(qū)別開，必須再增加一個(gè)指示系統(tǒng)，即硫化氫指示系統(tǒng)。因?yàn)閬唽佗蠼^大部分硫化氫試驗(yàn)陽性，而埃希氏菌屬硫化氫試驗(yàn)陰性。硫化氫指示系統(tǒng)中有含硫氨基酸及二價(jià)鐵鹽，亞屬Ⅲ分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫．硫化氫與鐵鹽反應(yīng)生成硫化鐵(FeS)黑色化合物，因此菌落為黑色或中心黑色。乳糖指示系統(tǒng)主要是為了分離沙門氏菌亞屬I，Ⅱ，Ⅳ，V，Ⅵ

硫化氫指示系統(tǒng)主要是為了分離亞屬Ⅲ?？傊?，既能分解乳糖又能產(chǎn)生硫化氫的即為沙菌亞屬Ⅲ56主要雜菌為大腸埃希氏菌，而兩者區(qū)別在于是否發(fā)酵乳糖，故加入乳糖、酸堿指示劑來判斷可以菌落。加入硫化氫是因?yàn)榈贗II屬產(chǎn)硫化氫而緩慢發(fā)酵乳糖BS選擇性最強(qiáng)，可延長時(shí)間以免沙門氏菌生長已被抑制多采用BS搭配XLD/HE/DHL/SS/WS等，互補(bǔ)防漏檢。指示系統(tǒng)指示效果及可疑菌落特點(diǎn)BS葡萄糖＋H2S菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變XLD乳糖＋H2S菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心HE乳糖＋H2S藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色WS乳糖＋H2SDHL乳糖＋H2S無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色SS乳糖＋H2SCHR-紫紅色樣品+BPW+SC+HE樣品+BPW+SC+XLD樣品+BPW+SC+CHRO豬肉樣品沙門氏菌的平板分離樣品+BPW+SC+BS4.4生化鑒定挑取兩個(gè)以上典型或可疑菌落，接種TSI瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺，同時(shí)接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板（NA）。

還可直接接種蛋白胨水、尿素瓊脂、氰化鉀培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。經(jīng)TSI瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的選擇后，可篩掉大部分非沙門氏菌株，大大減少了工作量，同時(shí)也滿足了API20E

或VitekGNI

鑒定的需要。59三糖鐵（TSI）反應(yīng)原理原理：三糖利用，是否產(chǎn)硫化氫培養(yǎng)基：高層斜面接種方式：劃線穿刺結(jié)果：產(chǎn)酸/堿、產(chǎn)氣、硫化氫乳糖(10g/L）蔗糖(10g/L)葡萄糖(1g/L)TSI配方蛋白胨20.0g牛肉膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亞鐵銨0.2g硫代硫酸鈉0.2g酚紅0.25gNaCl5.0g瓊脂20g蒸餾水1000mLpH7.5若分解H2S則產(chǎn)生黑色FeS沉淀，若分解糖類產(chǎn)氣則可見氣泡或裂縫只有斜面和底層均產(chǎn)酸，且賴氨酸脫羧酶陰性者才可排除為沙門氏菌的可能性其余情況即可能是也可能不是沙門氏菌屬的細(xì)菌三糖鐵（TSI）反應(yīng)模式及意義葡萄糖乳糖蔗糖說明＋＋＋分解糖類產(chǎn)酸→pH↓→指示劑變黃→斜面底層均產(chǎn)酸變黃為A/A模式＋－－斜面因葡萄糖含量少故分解完后利用蛋白胨產(chǎn)堿且大于酸量故由黃變?yōu)樯罴t，為K，底層無氧故緩慢分解葡萄糖而產(chǎn)酸變黃為A，K/A模式＋－＋由于乳糖或蔗糖量大，故斜面和底層均產(chǎn)酸變黃，亦為A/A模式＋＋－表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果622.本標(biāo)準(zhǔn)也保留了可以同時(shí)直接接種蛋白胨水

(供做靛基質(zhì)試驗(yàn))、尿素瓊脂

(pH7.2)、KCN培養(yǎng)基的內(nèi)容。本部分還增加了對(duì)疑似菌落進(jìn)行留樣確認(rèn)的部分，以備必要時(shí)復(fù)查，這對(duì)生化鑒定不確定的菌落進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證是非常必要的。3.采納API20E

或VitekGNI

為傳統(tǒng)生化鑒定方法的選擇性替代方法”。63/.../weishengwu/4-25-3-3-6.php2.1蛋白胨水＋靛基質(zhì)試劑：見A.8章靛基質(zhì)試驗(yàn)絕大多數(shù)沙菌：陰性

－/（＋）

目的：腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。原理：有些細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成紅色的玫瑰吲哚。642.2尿素瓊脂(pH7．2)：見A.9章。尿素酶試驗(yàn)，絕大多數(shù)沙菌：陰性－/（＋）

目的：通過分析尿素酶來進(jìn)行腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。原理：細(xì)菌產(chǎn)生的尿素酶分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基pH升高，用酚紅指示劑測(cè)出。652.3氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基：見A.10章。絕大多數(shù)沙菌：陰性－2.4賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：見A.11章。絕大多數(shù)沙菌：陽性＋反應(yīng)序號(hào)硫化氫（H2S）靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀賴氨酸脫羧酶A1+---+A2++--+A3----+/-注：+陽性；-陰性；+/-陽性或陰性表3沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表

p466

必要時(shí)按表5進(jìn)行沙門氏菌生化群的鑒別。表5沙門氏菌屬各生化群的鑒別項(xiàng)目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ衛(wèi)矛醇++--+-山梨醇+++++-水楊苷---+--ONPG--+-+-丙二酸鹽-++---氰化鉀（KCN）---++-注：+表示陽性；-表示陰性672.7半固體瓊脂：見第A.14章。

（供動(dòng)力觀察、菌種保存、H抗原位相變異試驗(yàn)等用。

一般用1.5％的，不凝集時(shí)用2.5％-3％的；有Vi時(shí)酒精燈火焰煮沸。H抗原發(fā)育不好時(shí)，用0.7％-0.8%上菌落的邊緣部分，或0.3％-0.4%遠(yuǎn)端取菌。）

2.8丙二酸鈉培養(yǎng)基：見第A.15章。

（沙菌生化群鑒別培養(yǎng)基，用新鮮的瓊脂培養(yǎng)物接種，于36℃±l℃

培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。陽性者由綠色變?yōu)樗{(lán)色。）（沙菌Ⅲ和Ⅴ為陽性＋：由綠變蘭；ⅠⅡⅣⅥ群為陰性－）68API20E生化鑒定系統(tǒng)3.1API20E生化鑒定試劑盒或VITEKGNI+生化鑒定卡11.API生化鑒定系統(tǒng)是法國梅里埃生物公司出品的微生物生化檢測(cè)系列產(chǎn)品，原理是利用細(xì)菌對(duì)于各類化學(xué)物質(zhì)（碳水化合物、氨基酸及蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽等）的代謝能力以及酶類的存在與否等生化特性來鑒定細(xì)菌的一種方法，當(dāng)反應(yīng)能夠?qū)е路磻?yīng)體系的pH變化或產(chǎn)生顯色物質(zhì)，加入合適的酸堿指示劑或顯色劑就可以反應(yīng)出來。API試驗(yàn)的本質(zhì)就是利用生化試驗(yàn)的方法，檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種物質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，常用于細(xì)菌的鑒別。69702.VITEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)

試驗(yàn)2-6h能出報(bào)告。判斷是某種菌的可能性是百分之幾。有時(shí)也需要進(jìn)行其他一些試驗(yàn)來進(jìn)一步確定，比如血清學(xué)反應(yīng)等。雖然該儀器是全世界比較好的，但因微生物鑒定工作的特殊性，其仍不能完全代替人工。

VITEK系列全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)是法國biosMerieumx生產(chǎn)的全自動(dòng)微生物分析儀的一個(gè)系列，包括：VITEK-32、VITEK-60、VITEK-120等。71VITEK自動(dòng)化微生物分析儀的組成VITEK自動(dòng)化微生物分析儀由充填機(jī)/封口機(jī)、讀取器/恒溫器、電腦主機(jī)及打印機(jī)組成充填機(jī)/封口機(jī)3min內(nèi)把樣本注入試驗(yàn)卡中及封口；讀取器/恒溫箱自動(dòng)恒定培養(yǎng)溫度并同時(shí)讀取卡內(nèi)生化反應(yīng)變化（系統(tǒng)依據(jù)不同型號(hào)，容納32至480張卡不等）；電腦主機(jī)負(fù)責(zé)分析資料的儲(chǔ)存、系統(tǒng)的操作及分析程式的運(yùn)作。72儀器的原理就是我們進(jìn)行細(xì)菌鑒定中使用的生化反應(yīng)。不過儀器把30個(gè)對(duì)細(xì)菌鑒定必需的生化反應(yīng)培養(yǎng)基固定到卡片上，然后通過培養(yǎng)后儀器對(duì)顯色反應(yīng)進(jìn)行判斷，利用數(shù)值法進(jìn)行判定;根據(jù)需要鑒定的微生物種類不同，設(shè)計(jì)了不同的鑒定卡片，比如革蘭氏陰性菌卡，革蘭氏陽性菌卡，酵母菌卡等。一般步驟

1．在試卡上填上標(biāo)本號(hào)，VITEK會(huì)自動(dòng)識(shí)別此號(hào)碼。2.將菌落分離，加鹽水后利用一支L型吸管，準(zhǔn)備將菌液傳送3．將試卡放入充填器，用真空原理，菌液會(huì)吸進(jìn)試卡的每個(gè)小孔內(nèi)，將底物溶解，然后封口。

4．將鑒定或藥敏試卡放入培養(yǎng)/讀數(shù)箱內(nèi)。5．最快可在插入試卡1h后，打印初步報(bào)告。

最終報(bào)告在試驗(yàn)完成后自動(dòng)打印出來優(yōu)點(diǎn)快速：鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)方法的18-24h相比,平均只需4-6h。對(duì)與快速生長細(xì)菌(大腸埃希氏、糞腸球菌、變形桿菌、克雷伯氏菌等)鑒定可提前到2h;操作簡(jiǎn)便：

全部操作自動(dòng)化，只須操作基本步驟，簡(jiǎn)單而方便；使用靈活：

隨時(shí)放入試卡進(jìn)行測(cè)試，VITEKSR測(cè)試容量可擴(kuò)充由32至480張卡75準(zhǔn)確可靠：

一般常見的細(xì)菌均可準(zhǔn)確的鑒定出來，SRF軟件可使工業(yè)用戶擴(kuò)展鑒定數(shù)據(jù)庫。資料處理：

bioLIAISON軟件集中管理實(shí)驗(yàn)室資料，設(shè)計(jì)報(bào)告形式、產(chǎn)品數(shù)據(jù)、鑒定結(jié)果及其他試驗(yàn)結(jié)果的處理。此軟件可額外配套統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控軟件。

獲得AOAC國際認(rèn)證：

保證提供的微生物鑒定結(jié)果是公認(rèn)的76生物梅里埃VITEK32微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK?2Compact

/jyk/instrument/jyk_micro-vitek-32.htm771.原理：免疫學(xué)原理

直接凝集反應(yīng)－－玻片凝集反應(yīng)玻片凝集反應(yīng)：是一種常規(guī)的定型試驗(yàn)方法，用已知抗體來檢測(cè)未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。將含有抗體的血清與待檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數(shù)分鐘后若出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，即為陽性反應(yīng)，證明該菌是沙門氏菌。

此法快速、簡(jiǎn)便，但不能進(jìn)行定量測(cè)定。4.5血清學(xué)鑒定78（2）抗體和抗原步驟：先多價(jià)后單價(jià)，先常見的后不常見的，先O后H，根據(jù)結(jié)果查表得到鑒定菌種多價(jià)血清：含多種抗體的血清，如A-F多價(jià)單價(jià)血清：含單一抗體的血清抗原準(zhǔn)備：一般采用1.2-1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。若O血清不凝集可轉(zhuǎn)種至高含量（2.5-3%）瓊脂培養(yǎng)基上，干燥有利于O-Ag發(fā)育。792.O抗原的檢測(cè)

先用9種多價(jià)O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。9種多價(jià)O血清：O多價(jià)1A，B，C，D，E，F(xiàn)群（并包括6，14群）O多價(jià)213，16，17，18，21群O多價(jià)328，30，35，38，39群O多價(jià)440，41，42，43群O多價(jià)544，45，47，48群O多價(jià)650，51，52，53群O多價(jià)755，56，57，58群O多價(jià)859，60，61，62群O多價(jià)963，65，66，67群80具體步驟：A～F多價(jià)O血清做玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)用生理鹽水做對(duì)照。在生理鹽水自凝者為粗糙形菌株，不能分型。被A～F多價(jià)O血清（混在一起的）凝集者，依次用群因子血清做凝集試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，判定O群：

O4(B群)；O3、O10（E群）；O7（C1群）；

O8（C2群）；

O9（D群）；O2（A群）和O11（F群）。血清被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19單因子血清做凝集試驗(yàn)，判定E1、E2、E3、E4各亞群；每一個(gè)O抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)O單因子血清的檢查結(jié)果，沒有O單因子血清的要用兩個(gè)O復(fù)合因子血清進(jìn)行核對(duì)。81圖玻片凝集法步驟先應(yīng)在玻片上滴加1滴生理鹽水，加入菌苔做陰性對(duì)照并觀察是否自凝，若有則說明該菌株發(fā)生S-R變異失去了O抗原成為粗糙型，故不能進(jìn)行血清學(xué)分型。H抗原的鑒定屬于A～F各O群的常見菌型，依次用表6所述H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。

表6A~F群常見菌型H抗原表836結(jié)果與報(bào)告

綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報(bào)告25g（ml）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。85－檢驗(yàn)步驟：五步法，約需4－5d2.選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢(shì)增殖，其它細(xì)菌受到抑制；3.選擇性平板分離培養(yǎng)：BS+XLD/HE/顯色培養(yǎng)基4.生化試驗(yàn)：鑒定分離出的細(xì)菌是否符合沙門氏菌的生化譜，可采用API20E等成套生化試劑5.血清學(xué)鑒定：特異性診斷血清鑒定到種1.前增菌：用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌恢復(fù)活力；復(fù)習(xí)題一、填空1、腸桿菌科的沙門氏菌屬中細(xì)菌的分類是按生化特性分為6個(gè)亞屬，用Ⅰ，Ⅱ～Ⅵ表示

，亞屬Ⅲ習(xí)慣上也叫亞利桑那菌；其中每種菌含2種以上有鑒別意義的菌體抗原（O抗原）具有相同的O抗原的菌種歸為一群，其中95%致病菌在A～F群中；按O抗原和鞭毛H抗原的不同分為近2500

個(gè)血清型。2、食物中毒癥狀：五種類型即胃腸炎型、類傷寒型、類霍亂型、類感冒型和敗血癥型。在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌食物中毒常占首位或第二位。引起沙門氏菌食物中毒的主要