大腸桿菌電轉(zhuǎn)和文庫擴增

科隆生物醫(yī)學有限公司?大腸桿菌基因電轉(zhuǎn)化（1）（制劑范圍可以放大或縮?。┍Ｃ芨袘獞B(tài)菌制備培養(yǎng)液和制劑：-無任何抗生素及含有氨芐青霉素/carbnicillin或其他適當抗生素的LB平板-2XLB或YT培養(yǎng)基500毫升-SOC培養(yǎng)基-冰冷的高壓滅菌去離子水：1000毫升-冰冷的高壓滅菌10%甘油（500毫升）-預冷卻的50ml離心管，離心管和電轉(zhuǎn)移杯。方法：1。 從一個新鮮的瓊脂平板上接種單個大腸桿菌單菌落到含有5ml的2XYT培養(yǎng)基的燒瓶中。孵育培養(yǎng)5小時或過夜，于37^和250rpm旋轉(zhuǎn)振蕩器培養(yǎng)。2。 用5ml過夜的細菌培養(yǎng)物接種到在2升燒瓶中500毫升預熱的2XYT培養(yǎng)基中。于37°C攪拌下（250轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)振蕩器）。一個小時以后，每20分鐘測定OD600值。3。 當培養(yǎng)物的OD600達到0.2.5-0.3，迅速將燒瓶轉(zhuǎn)移到冰水浴中15-30分鐘。偶爾轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶以確保冷均勻。4。 轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物至50ml冰冷的離心瓶。在4500rpm和在2C下離心10分鐘，收獲細胞倒出上清液和重懸細胞沉淀在50毫升冰冷的純水并在2C下孵育3分鐘。5。 通過在2C下離心10分鐘收獲細胞（4500rpm）,倒出上清液和重懸細胞沉淀在50毫升冰冷的純水中并孵育3分鐘。6。 通過在2C下離心15分鐘收獲細胞（4500rpm），倒出上清液和重懸細胞沉淀在25毫升冰冷的10%甘油中。7。 通過在2C下離心15分鐘收獲細胞（4500rpm），倒出上清液和重懸沉淀在10毫升冰冷的10%甘油。8。 通過在2C下離心15分鐘收獲細胞（4500rpm），小心地倒出上清液，并使用巴斯德吸管殘余水滴。合并和重懸沉淀于1毫升冰冷的10%甘油。9。 測量1:100稀釋的細胞懸浮液的OD600值：用冰冷的10%甘油稀釋細胞懸液，然后測定。濃度應是210”到3x1010個細胞/ml OD=800-120（1.0OD600=約2.5x108細胞/ml）。10。 轉(zhuǎn)移40微升的懸浮于冰冷的電穿孔杯中（0.1厘米間隙）并放電施加是否發(fā)生電?。ㄕ垍㈤喯挛牡?2到18步）。如果是這樣，用冰冷的10%甘油洗滌的細胞懸浮液的剩余部分再次，以確保細菌懸浮液的導電率足夠低（＜5毫當量）。11。 如無電弧發(fā)生，就進行存儲，分配所述40微升細胞懸浮液等份放入無菌的，冰冷的0.5-ml離心管，并立即轉(zhuǎn)移到-80C的冰箱中。12。 加入10毫微克，容積不超1-3微升DNA到每個離心管，并在冰上孵育管60秒或以上。包括所有適當?shù)年栃院完幮詫φ?。質(zhì)粒量為細胞體積不能達到十分之一。13。 設置電轉(zhuǎn)儀提供的電容25mF，2.5千伏和200歐姆電阻的電脈沖。14。 轉(zhuǎn)移DNA/細胞混合物倒入冷電比色皿，并確保細菌和DNA的懸浮坐在試管的底部。干燥凝結(jié)和濕氣的反應杯的外側(cè)。將試管中的電穿孔設備。15。 在上面設置中，釋放一個4-5毫秒脈沖電力。12.5千伏/厘米的探測或磁場強度的時間常數(shù)應該在屏幕上顯示。16。 盡可能快的脈沖后，取出電穿孔杯，在室溫下，加入0.5mlSOC培養(yǎng)基。17。 將細胞轉(zhuǎn)移到一個含有0.5毫升SOC的17X150毫米的聚丙烯管中，于37C下慢轉(zhuǎn)動（250轉(zhuǎn)）培養(yǎng)1小時.18。 涂0.5hml培養(yǎng)液、于抗菌素LB板上,370C下隔夜培養(yǎng)，檢測轉(zhuǎn)化效率.cDNA質(zhì)粒文庫擴增培養(yǎng)液和制劑：-質(zhì)粒文庫培養(yǎng)基：混合200毫升2xLB（pH值7.0）+0.4%超低膠凝溫度的瓊脂糖（SeaPrep品牌或其他）并分發(fā)50毫升于各200毫升燒杯中。高壓滅菌后，允許LB+瓊脂糖冷卻至50^，并添加氨芐青霉素（或其他抗菌素），50微克/毫升，放置在37°C,并直至加入細胞。-質(zhì)粒文庫培養(yǎng)板（選擇性）：4x150mm含有抗菌素的LB’平板方法：加3微升的DNA到冰冷40微升電感受態(tài)管中（菌落應10倍高濃度高于所需DNA）的管中。轉(zhuǎn)移混合物到已在冰中0.1厘米電反應杯（己冷卻了5分鐘）.混合后，并在使用前并且擦干反應杯面上的冰和水。調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)儀到25pF，200歐姆，2.5千伏.在上面設置中，釋放一個4-5毫秒脈沖電力。12.5千伏/厘米的磁場強度（應該在屏幕上顯示）；電穿孔后，然后立即加1毫升SOC培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移到含有1毫升的15毫升培養(yǎng)管和在37C培養(yǎng)1小時。（5.（選擇性），混合10pL培養(yǎng)液和90微升SOC，并涂板（LB+入1^?），在37C孵化過夜。第二天，計數(shù)菌落每個平板，并確定其中的DNA稀釋給出菌落的期望數(shù)目。）總庫擴增：加入約480-500微升細胞到各個含有LB-抗菌素-瓊脂糖的50毫升培養(yǎng)基，（或加入約480-500微升細胞到各個含有抗菌素的150mmLB’平板）將每個已經(jīng)加了培養(yǎng)液的燒杯放在在冰水桶中一小時左右，讓瓊脂糖凝固。仔細轉(zhuǎn)移到37C培養(yǎng)箱，沒有任何晃動。培養(yǎng)兩個晚上（44-48小時），應該看到的小菌落懸浮在LB+瓊脂糖。確定菌落會下沉到試管底部（均相性）。使用中量質(zhì)粒試劑盒純化質(zhì)粒&）倒入