動物分子遺傳育種學第4章課件

概念：轉(zhuǎn)基因動物是指通過DNA操作過程將外源基因整合在染色體基因組內(nèi)并能遺傳給后代的一類動物。

第三章轉(zhuǎn)基因動物育種（自1982以來）已成功：小鼠、大鼠、兔、豬、綿羊、山羊、牛、雞、魚等多種轉(zhuǎn)基因動物。第一節(jié)動物轉(zhuǎn)基因技術的理論基礎染色體交換與基因轉(zhuǎn)移：聯(lián)會轉(zhuǎn)座子基因組內(nèi)轉(zhuǎn)基因（自然產(chǎn)生）

生物界的這些現(xiàn)象及其發(fā)現(xiàn)是轉(zhuǎn)基因動物得以產(chǎn)生的一個基礎。轉(zhuǎn)基因的表達特征：（1）時空特異性表達（2）可控性表達（3）共抑制性（當轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因存在同源關系時，二者的表達均受到抑制，其原因極其復雜，目前尚未完全清楚）（4）沉默現(xiàn)象原因：a.整和在不適當?shù)牟课?。b.被受體細胞識別為異己DNA后將其甲基化而失活。c.轉(zhuǎn)基因本身構建不恰當，而無法轉(zhuǎn)錄表達。轉(zhuǎn)基因動物的成功率受精卵（開始）…轉(zhuǎn)基因動物子代（結(jié)束）總成功率：陽性動物子代數(shù)待轉(zhuǎn)基因受精卵數(shù)物種受胎率%產(chǎn)仔率%整和率%總成功率%牛20105-100.5羊40155-101豬40510-150.5圖5010101大鼠6010-20152小鼠80-244不同動物的轉(zhuǎn)基因成功率動物轉(zhuǎn)基因的技術：（1）上游技術：是指利用分子遺傳學和分子生物學技術進行基因改造，載體構建，最后組裝成轉(zhuǎn)基因單位的一系列方法技術。（2）中游技術：

包括外源基因?qū)胧荏w細胞、胚胎移植、轉(zhuǎn)基因動物的繁育建系等。

（3）下游技術：

是指轉(zhuǎn)基因的整和表達情況的檢測。下游技術的檢測方法：（1）在染色體和DNA水平上：

a.Southern雜交b.PCR擴增c.熒光原位雜交（2）在mRNA水平上：a.Nouthernblot雜交b.RT-PCR擴增（3）在Pr水平上：Westernblot雜交。（4）表型水平上：檢測轉(zhuǎn)基因動物在生長速度、抗病性、產(chǎn)品質(zhì)量等方面與原來動物有無差異。第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動物的研究方法轉(zhuǎn)基因動物的常用方法：（1）顯微注射法（2）逆轉(zhuǎn)錄病毒法（3）胚胎干細胞法（4）精子載體法顯微注射法：外源基因構建準備受精卵顯微注射胚胎移植轉(zhuǎn)基因檢測

優(yōu)點：（1）安全（無病毒基因組序列）（2）轉(zhuǎn)移率高（整合率達30%）（3）相對較短周期內(nèi)可得到純合體缺點：（1）設備昂貴，所需技術性很強。（2）轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)無法控制，通常為多拷貝，最多可達幾百個（3）通常在插入點引起突變（重組、缺失）造成動物生理缺陷顯微注射法：逆轉(zhuǎn)錄病毒法：逆轉(zhuǎn)錄病毒：

是一種整合性的單鏈RNA病毒。該方法就是將外源基因重新組合在逆轉(zhuǎn)錄病毒載上，然后在去感染著床前或著床后的胚胎，將外源基因?qū)雱游锛毎麅?nèi)，是目前開展動物轉(zhuǎn)基因研究中最有效的方法一。優(yōu)點:（1）整合率高。（2）單位點、單拷貝。（3）插入位點的克隆分析較容易。缺點:（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒容量小，轉(zhuǎn)移片段一般小于10kb，故被轉(zhuǎn)入基因通常無調(diào)空序列。（2）病毒基因組有可能與外源基因一起整合到受體細胞染色體上，造成轉(zhuǎn)基因動物的污染，限制了其在商業(yè)轉(zhuǎn)基因動物中的應用。逆轉(zhuǎn)錄病毒法：胚胎干細胞法

通過顯微注射法或逆轉(zhuǎn)錄病毒法將外源基因引入到ES細胞內(nèi)，使外源基因整合到ES基因組內(nèi)某一非必需基因位點上,再對ES細胞進行篩選鑒定和培養(yǎng)擴增,用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物.優(yōu)點:(1)外源基因整合與表達可以在干細胞中檢測.(2)可以對外源基因進行定點整合.缺點:需要經(jīng)過多代的選育,才能得到純合的轉(zhuǎn)基因動物,這對牛、羊等產(chǎn)仔數(shù)少，世代間隔長的大動物來講是很困難的。胚胎干細胞法精子載體法

利用精子作為轉(zhuǎn)移外源基因的載體，通過受精將外源基因帶入卵細胞，并整合在染色體上的一種方法。實際上很早以前，人們就已發(fā)現(xiàn)，通過受精過程，精子可以將外源基因帶入卵細胞。但到目前為止，人們尚不清楚這種過程的確切機制。不過這并不影響精子載體法在轉(zhuǎn)基因動物研究中的應用。精子與外源基因結(jié)合的部位：（1）精子的整個頭部區(qū)域。（2）精子的頭前區(qū)域。（3）精子的頭后區(qū)域。該種結(jié)合一般不出現(xiàn)在精子的尾部。影響精子與外源基因結(jié)合的因素：（1）外源基因的大小（大優(yōu)于?。＃?）精子頭部的特異性蛋白質(zhì)（有促進）（3）清洗精子（有促進）外源基因的存在方式：（1）整合到受體細胞的染色體上。（2）外源基因以附加體的形式存在（易丟失，但通過設計增加自主復制序列可以穩(wěn)定存在，并正確表達而得到轉(zhuǎn)基因動物）。優(yōu)點：（1）方法簡單實用，只通過人工受精就可生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。（2）以附加體形式得到的轉(zhuǎn)基因動物在理論上可以不受受體基因組的影響，以達到特異性表達精子載體法第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動物育種現(xiàn)狀轉(zhuǎn)基因動物育種包括兩個方面：（1）常規(guī)性轉(zhuǎn)基因動物育種：直接轉(zhuǎn)入高產(chǎn)基因（低產(chǎn)高產(chǎn)）。（2）動物生物反應器（乳腺、血液等）。常規(guī)性轉(zhuǎn)基因動物育種：在國內(nèi)外均開展了相關技術的研究。例如：轉(zhuǎn)入人GH基因的豬在生長速度、飼料利用率、胴體瘦肉率方面有了明顯的改善。但轉(zhuǎn)基因普遍體質(zhì)下降，表現(xiàn)出病態(tài)現(xiàn)象，特別是胃病、關節(jié)病明顯增加。因此，如用常規(guī)性轉(zhuǎn)基因動物培育新的動物品種尚需做很多基礎性研究工作。綿羊和魚:這兩種動物的轉(zhuǎn)基因個體沒有發(fā)現(xiàn)健康和繁殖性能方面的異常，大有希望培育新品種應用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。列外:非常規(guī)轉(zhuǎn)基因動物育種（動物生物反器）：

動物生物反應器的出現(xiàn)生物技術領域和畜牧業(yè)的一次革命，具有重要而深遠的意義。畜產(chǎn)品工業(yè)產(chǎn)品

目前發(fā)展最快的是動物乳腺生物反應器，用來生產(chǎn)藥用蛋白或酶蛋白，是一種全新的生產(chǎn)模式，其優(yōu)越性：（1）動物乳腺是一個封閉系統(tǒng)，可避免外源基因表達產(chǎn)物對動物健康造成的危害。（2）乳腺組織對外源表達產(chǎn)物進行正確的加工和修飾，使其具有天然產(chǎn)品相似的生物活性。（3）在乳腺中表達的目的基因可以遺傳（可擴繁）利用動物生物反應器生產(chǎn)產(chǎn)品時，不同動物其開發(fā)利用價值差異極大。故在選擇轉(zhuǎn)基因動物時，需考慮如下因素：（1）世代間隔（2）產(chǎn)仔數(shù)（3）抗病力（4）飼養(yǎng)成本（5）目的基因產(chǎn)物的多少不同轉(zhuǎn)基因動物開發(fā)利用價值比較及評價物種優(yōu)點缺點評價牛產(chǎn)奶量高，易飼養(yǎng)世代間隔長，成本高理想動物山羊泌乳性能良好產(chǎn)奶量比牛低理想動物豬世代間隔短，產(chǎn)仔數(shù)多轉(zhuǎn)基因豬生活、繁殖力差開發(fā)價值不大兔乳蛋白含量高，繁殖率高產(chǎn)奶量低有開發(fā)價值鼠乳腺表達許多蛋白，可作為生物反應器的模型產(chǎn)奶量極低有開發(fā)價值昆蟲蠶、蠅等昆蟲繁殖率特高，飼養(yǎng)成本低，外源基因易整和，易于大規(guī)模生產(chǎn)。蠅類使人心理不舒服成本低，開發(fā)價值大。轉(zhuǎn)基因動物中存在的主要問題：（1）外源基因的整合率和總成功率低，已經(jīng)整合的外源基因易于丟失，遺傳率也低。（2）外源基因的表達不理想。（3）外源基因常導致受體動物基因突變或功能紊亂。轉(zhuǎn)基因動物的育種前景：

目前，人們在轉(zhuǎn)基因動物育種中，已經(jīng)取得了一定的經(jīng)濟效益。特別是非常規(guī)性的轉(zhuǎn)基因動物育種中。動物生物反應器投資相對少，效益大，無公害。荷蘭的Genpharm公司（1990）培育的帶有人LF的轉(zhuǎn)基因奶牛，制造嬰兒奶粉的年產(chǎn)值達50億美元。

英國的PPL公司（1991）培育