基因組DNA變異的檢測課件

人類疾病易感基因鑒定大賽系列講座內(nèi)容：一、生物實驗室規(guī)范與微量移液器操作 （俞建瑛副教授）二、基因組DNA的提取和酶切 （李素霞副教授）三、PCR原理與技術(shù) （吳海珍副教授）四、基因組DNA變異的檢測 （歐陽立明副教授）人類疾病易感基因鑒定大賽

系列講座之四

基因組DNA變異的檢測Teacher:歐陽立明博士生物工程學院·應(yīng)用生物學系2008.7奉賢Contentsp53基因與腫瘤個體基因組差異PCR-RFLP檢測技術(shù)本實驗整體流程4123生命的核心奧秘生命的奧秘？多樣性發(fā)育的時空特異性對環(huán)境的反應(yīng)遺傳與變異都可以從基因組中找到答案！什么是基因組？

基因組（Genome）——生物體全部的遺傳物質(zhì)；原核生物的基因組真核生物的基因組：細胞核；細胞器生物體——對基因組信息復制、傳遞、解碼的復雜系統(tǒng)。人類基因組概況TheHumanGenomeProject(HGP)是代表性測序：24條染色體（22條常染色體+X+Y）；3×109堿基只有約3%DNA編碼蛋白質(zhì)約3~4萬個基因個體基因組差異中的秘密為什么？為什么每個人相貌、性格、智力……都不一樣？為什么有的人容易得病，有的人卻對疾病的免疫能力特別高？為什么在藥物的使用過程中，有的人一用就靈，有的人卻不靈，甚至中毒？這些現(xiàn)象使人們認識到：必須從不同個體基因組序列的多態(tài)性上去闡明個體對疾病和藥物反應(yīng)上的多態(tài)性，才能真正了解與疾病特別是多基因疾病有關(guān)的遺傳機制，同時深入了解人類起源、進化和遷徙過程中的DNA序列變化?；蚪M差異的主要表現(xiàn)SNP(Singlenucleotidepolymorphism)：單核苷酸多態(tài)性，基因組中數(shù)量最多的分子標記SSLP(Simplesequenceslengthpolymorphism)，簡單序列長度多態(tài)性，也稱微衛(wèi)星(Microsatellite)Insertionanddeletion(Indel)：堿基的插入和缺失SNP的特點就好像單詞的變體或者中文中的通假字在基因組中大量存在，已經(jīng)報道了超過300萬個SNP，估計整個人類中存在1500萬個SNP一般為二等位性轉(zhuǎn)換(transition,如A→G)高于顛換(transversion,如A→T)同一位點極少發(fā)生再次復制錯誤30%位于編碼區(qū)，70%位于非編碼區(qū)DNA的雙鏈互補結(jié)構(gòu)同源染色體、姐妹染色單體、等位位點一對同源染色體一對姐妹染色單體A,a：一對等位位點同源染色體、姐妹染色單體、等位位點同源染色體：是指形態(tài)、結(jié)構(gòu)、遺傳組成基本相同的染色體。對于同一個體來說，同源染色體對在減數(shù)第一次分裂前期中彼此聯(lián)會(配對)，并且能夠形成四分體，然后分裂到不同的生殖細胞的一對染色體，一個來自母方，另一個來自父方。姐妹染色單體：姐妹染色單體是由一個著絲點連著的并行的兩條染色單體，是在細胞分裂的間期由同一條染色體經(jīng)復制后形成的。等位位點：個體或群體同源染色體上相同的位置。四分體每個四分體都有2條染色體，2對姐妹染色單體，4個DNA分子。由于四分體時期同源染色體之間經(jīng)?；ハ嗬p繞，再分開時不一定能維持染色體原來的形態(tài)和組成，有可能發(fā)生同源非姐妹染色體之間的交叉互換，這是染色單體上，也是不久之后染色體上基因重組的原因。

SNP的含義同一個體或不同個體基因組中等位位點上的單核苷酸堿基不同。對于二倍體生物，等位位點上的SNP有雜合、純合之分！SNP與DNA突變：都起源于DNA復制差錯。SNP具有相對穩(wěn)定性，一般來說在群體中出現(xiàn)頻率大于1%；而突變不具有穩(wěn)定性，在群體中存在的頻率小于1%。編碼區(qū)的SNP與疾病或藥物反應(yīng)個體差異關(guān)系密切，是制藥企業(yè)的金礦四種后果：同義Synonymous：

AAA(Lys)AAG(Lys)(silentmutation)無義non-sense：TGG(Trp)TGA(Stop)錯義mis-sense：AGU(Ser)ATU(Ile)。一些單基因遺傳病的病因。sicklecellanemia,hemoglobin146residue(GAG(Glu)GTG(Val)改變基因的表達SNP的演化過程如何檢測SNP或突變酶法：根據(jù)酶對DNA序列的識別特異性限制性內(nèi)切酶:RFLPDNA連接酶DNA聚合酶在合成時的校正功能：TaqMan?構(gòu)象分離法：電泳檢測DNA的構(gòu)象變化單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）異源雙鏈電泳遷移率變化dHPLCDNA雜交法：堿基變化對DNA互補配對雜交動力學的影響DASH,DNAchip,ASO斑點雜交等直接測序法焦磷酸測序（Pyrosequencing）單堿基延伸標簽測序：(SingleBaseExtension,SBEtag)FluorescentDyeTerminator;Fluorescencepolarization;MS;MALDI-TOFRCR-RFLP檢測SNP或突變原理：由于堿基的變異可引起酶切位點的消失或出現(xiàn)，從而使不同個體同一位置的基因組片段（用PCR擴增獲得）用同一限制性內(nèi)切酶酶切時，產(chǎn)生的DNA片段長度有差異，即限制性片段長度多態(tài)性（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）。Animation基于雜交的RFLP提取基因組→酶切→特異性探針DNA雜交注意等位位點上SNP的雜合、純合在檢測結(jié)果上的差異！RFLP的特征可遺傳給子代并符合孟德爾規(guī)律。基因組變異的數(shù)據(jù)庫1)NCBI的遺傳變異數(shù)據(jù)庫（dbSNP）/SNP/index.html2)SNP研究聯(lián)盟（TheSNPConsortium,TSC）提供的數(shù)據(jù)庫：/db/snp/mHp3)人類基因組突變數(shù)據(jù)庫（theHumanGenomeVariation,HGVbase）http://hgvbase.cgb.ki.sep53基因與腫瘤p53是一個抑癌基因，可誘導異常細胞進入凋亡。幾乎所有的腫瘤和約50%的惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了p53基因的突變或缺失。突變的結(jié)果是90%導致翻譯出的氨基酸發(fā)生改變，10%是不能形成P53蛋白。

Moredetailspleasereferto:.sg/index.phphttp://p53.free.fr/p53基因的結(jié)構(gòu)P53基因位于人17號染色體短臂（17p13），有11個外顯子。粉紅色區(qū)域所示部分不編碼結(jié)構(gòu)蛋白，灰色區(qū)域為內(nèi)含子內(nèi)部的外顯子，藍色為蛋白編碼區(qū)。P53蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)脯氨酸富含區(qū)，與DNA損傷介導的細胞凋亡有關(guān)核心結(jié)構(gòu)區(qū)(DNA結(jié)合區(qū))，突變高發(fā)區(qū)，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。核定位信號（NLS），高度保守p53的突變位點統(tǒng)計突變熱點位于DNA結(jié)合區(qū)p53熱點突變的類型人類腫瘤p53基因突變腫瘤類型突變頻率（％）突變熱點（密碼子）肺癌56157，248，273結(jié)腸癌50175，245，248，273卵巢癌44273胰腺癌44273皮膚癌44248,278胃癌41不確定頭頸部鱗癌37248膀胱癌24280前列腺癌30不確定肝細胞癌45249膠質(zhì)瘤25175,248乳腺癌22175，248，273子宮內(nèi)膜癌22248甲狀腺癌13248，273白血病12175，248

食管癌45不確定PCR擴增區(qū)域圖解Codon248cCGG(Arg)→cTGG(Trp)cCTG(Leu)cCAG(Gln)↓MspI248位密碼子的突變類型預期電泳結(jié)果正常PCRGenome100bp200bp300bp500bpDNAMarkerFig.1PCR-RFLPresultofp53geneM1:Marker3(200,500,800…)bp;1:GenomeDNA2:PCRresultofexon7fragmentofp53geneM2:100bpladderDNAMarker3:Digestionresult200bp500bp800bpM112M23大賽實驗流程（PCR-RFLP）1)個體基因組提取2)P