生殖毒性研究現(xiàn)狀及進展

藥物生殖毒性研究現(xiàn)狀及進展上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）孫祖越上海市計劃生育科學(xué)研究所中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心世界衛(wèi)生組織人類生殖研究合作中心二一四年七月十一日·

上海培訓(xùn)提綱第一部分：新藥生殖毒性研究的概念（何意？）第二部分：新藥生殖毒性研究的起因（何故？）第三部分：新藥生殖毒性研究的內(nèi)容（何為？）第四部分：新藥生殖毒性研究的進展（何往？）上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）內(nèi)涵：是一門研究藥物對雌雄生命生殖系統(tǒng)及其功能活動毒副現(xiàn)象及其作用機制的科學(xué)。它包括對動物的精卵形成、交配、排卵、射精、合子形成、著床、妊娠、分娩和哺乳過程；從生殖細胞分化到整個細胞發(fā)育，從胚胎細胞發(fā)育到個體器官形成，從親體繁殖能力到后代生殖功能，其間涉及到的親子代生殖系統(tǒng)器官結(jié)構(gòu)、生理和生化功能、遺傳和生殖特征，諸如此類方面的毒理學(xué)研究。是毒理學(xué)的重要分支。外延：藥物生殖毒性研究主要包括生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗（也稱一般生殖毒性試驗，Ⅰ段生殖毒性試驗）、胚胎－胎仔發(fā)育毒性試驗（也稱致畸敏感期毒性試驗，Ⅱ段生殖毒性試驗）和圍產(chǎn)期毒性試驗（Ⅲ段生殖毒性試驗）等。目的：藥物生殖毒性研究的目的是通過動物試驗反映供試品對哺乳動物生殖功能和發(fā)育過程的影響，預(yù)測其可能產(chǎn)生的對生殖細胞、受孕、妊娠、分娩和哺乳等親代生殖機能不良影響，以及對子代胚胎—胎兒發(fā)育、出生后發(fā)育的不良影響。上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）第一部分：新藥生殖毒性研究的含義第二部分：新藥生殖毒性研究的起因反應(yīng)停事件：1956年，德國格倫南蘇藥廠生產(chǎn)銷售Thalidomide（又稱反應(yīng)停、沙利度胺、肽咪哌啶酮），曾經(jīng)有100萬人服用，至1963年全世界共發(fā)現(xiàn)海豹肢畸形兒1.2萬多人。海豹肢畸形：上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）經(jīng)典方法一、生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗（Ⅰ段生殖毒性試驗，也稱一般生殖毒性試驗）二、胚胎－胎仔發(fā)育毒性試驗（Ⅱ段生殖毒性試驗，也稱致畸敏感期毒性試驗）三、圍產(chǎn)期毒性試驗（Ⅲ段生殖毒性試驗）上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）第三部分：新藥生殖毒性研究的內(nèi)容大

鼠

胚

胎

發(fā)

育

時

期

簡

表為何設(shè)計三段生殖毒性研究？上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）妊娠天次典型事件出現(xiàn)系統(tǒng)形成系統(tǒng)妊娠天次典型事件出現(xiàn)系統(tǒng)形成系統(tǒng)11個細胞出現(xiàn)11前肢芽出現(xiàn),后神經(jīng)孔關(guān)閉22個細胞出現(xiàn)12尾芽出現(xiàn)34-8個細胞出現(xiàn)13后足板形成,松果體凹出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)4桑椹胚出現(xiàn)14/5孵出囊胚15口蓋板閉鎖，體表出現(xiàn)毛囊6內(nèi)胚層出現(xiàn)16冠狀血管明顯腭突融合心血管系統(tǒng)消化系統(tǒng)7卵圓柱和外胚層出現(xiàn)17REICHERT膜破裂8早期原條和神經(jīng)板出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)19肺泡管形成呼吸系統(tǒng)9尿囊、前腸、卵黃囊臟層島出現(xiàn)心血管系統(tǒng)消化系統(tǒng)20/10尿囊與絨毛膜接觸原生殖細胞泌尿系統(tǒng)生殖系統(tǒng)21出生第-9周第-8周第-7周第-6周第-5周第-4周第-3周第-2周第-1周雄鼠解剖第-2周第-1周第1周第2周第3周第4周第5周第6周第1周第2周第3周第4周第5周第6周第7周第8周F0代雄鼠F1代仔鼠F0代雌鼠：分娩點：交配點：離乳點：性成熟圖例：Ⅰ段Ⅱ段Ⅲ段上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）兩代孫祖越，周莉，閆晗，何桂林.如何成功地開展藥物臨床前生殖毒性試驗.中國新藥雜志.2011，20（22）：1651-1660.如何設(shè)計三段生殖毒性研究？三、經(jīng)典方法–1：生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗（Ⅰ段）上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）

《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則.2006，11.

1、目的：觀察供試品是否對動物的生育力和早期胚胎發(fā)育存在影響。2、試驗方法和觀察指標(biāo)：（1）試驗方法：雄鼠交配前連續(xù)給藥9周，雌鼠交配前連續(xù)給藥2周，按1:1合籠每天上午作陰道涂片檢查，查到精子或陰栓日定為妊娠GD0，雌鼠繼續(xù)給藥至GD7，雄鼠交配成功后停藥處死，二周內(nèi)未交配上雌、雄大鼠停藥處死，對雄鼠生殖系統(tǒng)的器官和精子質(zhì)量進行檢查。交配成功的妊娠大鼠于GD14處死，解剖檢查。（2）觀察指標(biāo)：①一般狀況：外觀體征、死亡、體重、攝食量、陰道涂片、交配行為；②雌性大鼠指標(biāo)：黃體、受孕率、妊娠率、著床數(shù)、生殖器官系數(shù)、相關(guān)器官組織病理學(xué)檢查、相關(guān)激素水平；③雄性大鼠指標(biāo)：生殖器官臟器系數(shù)臟器系數(shù)、組織病理學(xué)檢查；精子活率、精子數(shù)量和精子形態(tài)觀察分析；交配成功率、生育率和交配行為，相關(guān)激素水平；④胎仔指標(biāo)：活胎、死胎和吸收胎數(shù)量，胎仔外觀及活胎連子宮的重量。上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）三、經(jīng)典方法–2：胚胎－胎仔發(fā)育毒性試驗（Ⅱ段）

《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則.2006，11.

1、目的：觀察供試品對妊娠大鼠、胚胎及胎仔發(fā)育的影響。2、試驗方法和觀察指標(biāo)：（1）試驗方法：雄鼠、雌鼠合籠交配，次日上午陰道涂片檢查，查到精子定為妊娠GD0，妊娠GD6開始給藥至妊娠GD15，妊娠GD20處死母鼠，解剖，取出胎仔，檢查黃體數(shù)、胎重（連子宮）、胎盤重量、活胎數(shù)、死胎數(shù)（含吸收胎）、胎仔性別、重量、頂臀長及外觀。取1/2胎仔用茜素骨骼染色液染色作骨骼畸形檢查；另取1/2胎仔用Bouin氏液固定作內(nèi)臟檢查。

（2）觀察指標(biāo)：①一般狀況：妊娠第0、3、6、10、13、15和20天孕鼠體重；GD0、GD7、GD14和GD20的攝食量；GD20處死母鼠，取出胎仔，檢查黃體數(shù)、胎重（連子宮）、胎仔總重、胎盤重量、胎盤外觀、活胎數(shù)、死胎數(shù)（含吸收、胎仔性別、重量、頂臀長及外觀、內(nèi)臟、骨骼，并計算著床數(shù)；激素水平。②胎仔畸形檢查：

A頭部畸形檢查：有無腦積水、露腦、腦疝、腦膜膨出、無眼、小眼、無耳、腭裂；

B四肢畸形檢查：有無多趾、并趾、少趾、無趾、足內(nèi)翻、短趾；

C軀干畸形檢查：有無臍疝、腹裂、脊髓膨出、脊柱裂、脊柱側(cè)突；

D尾巴畸形檢查：有無短尾、卷尾、無尾、尾分叉；

E肛門畸形檢查：有無肛門閉鎖；

F骨骼畸形檢查：頭顱是否完整，骨化程度；有無胸骨節(jié)缺失、骨化不全、雙骨化點、胸骨節(jié)錯位、多肋、少肋、肋骨分叉、肋融合、波狀肋；有無四肢骨骨化不全、粗短、畸形、多趾、少趾等；

G器官畸形檢查：有無腭裂、舌異常、鼻道擴大、單鼻道、腦水腫、腎積水；眼球是否正常；心、肝、脾、肺、腎、子宮等臟器大小和位置是否異常。上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）三、經(jīng)典方法–3：圍產(chǎn)期毒性試驗（Ⅲ段）

《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則.2006，11.

1、目的：觀察供試品對妊娠、哺乳雌鼠以及胚胎和子代發(fā)育是否有影響。2、試驗方法和觀察指標(biāo)：（1）試驗方法：雌鼠、雄鼠按2:1合籠交配，于當(dāng)日下午5時后合籠，次日上午作陰道涂片檢查，查到精子或陰栓確定為妊娠GD0。雌鼠從妊娠GD15起，開始給藥至仔鼠斷乳（出生后第21天），停藥后頸椎脫臼法處死母鼠，解剖，肉眼觀察，如有異常作病理學(xué)檢查。仔鼠出生4天后，每窩留仔鼠8只（雌、雄各4只），若雌雄比例不均，總數(shù)仍保持8只，以維持哺乳的平衡，若每窩仔鼠數(shù)不足8只，則不剔除仔鼠?；螜z查；另取1/2胎仔用Bouin氏液固定作內(nèi)臟檢查。

（2）觀察指標(biāo)：①母鼠：母鼠的體重、攝食量、分娩時間、產(chǎn)仔數(shù)、死亡率和激素水平等。②仔鼠：

A外觀畸形（數(shù)）率、幼仔出生時的存活（數(shù)）率、哺育期間的成活（數(shù)）率、性別比例和生長指數(shù)；

B仔鼠生理發(fā)育和斷乳前神經(jīng)發(fā)育測試：生理發(fā)育記錄耳廓分離、出毛、門齒萌出、張耳、睜眼、龜頭包皮腺裂開和陰道張開的時間；反射發(fā)育指標(biāo)記錄出現(xiàn)平面翻正（從出生后第2天開始檢測）、懸崖回避（出生后第3天開始檢測）、瞳孔反射（從睜眼后開始檢測）和聽覺驚愕反射（從出生后第7天開始檢測）達標(biāo)時間；

C仔鼠自主及行為活動功能測試：測定出生后第10天仔鼠5分鐘內(nèi)的自發(fā)活動次數(shù)，出生后第20天仔鼠的游泳行為和游泳時間；

D仔鼠的生殖功能測試：F1代小鼠的交配率和受孕率。技術(shù)：發(fā)情周期中大鼠陰道涂片結(jié)果1、SD大鼠發(fā)情前期（巴氏X66）

2、SD大鼠發(fā)情期（巴氏X66）

3、SD大鼠發(fā)情后期（巴氏X66）

4、SD大鼠發(fā)情間期（巴氏X66）

上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）一、新物生殖毒性研究內(nèi)容更加深入細致二、藥物生殖毒理評價技術(shù)更加嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）第四部分：新藥生殖毒性研究的進展（一）生殖器官概念擴大化（二）研究技術(shù)水平縱深化（三）生殖毒性概念健康化（四）生殖毒性研究功能化（五）生殖毒性研究人群化上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）一、新藥生殖毒性研究更加深入細致傳統(tǒng)男性生殖器官現(xiàn)代男性生殖器官

睪丸附睪輸精管射精管陰莖等

睪丸附睪輸精管射精管陰莖前列腺包皮腺精液囊提肛肌肛門括約肌

等上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）（一）生殖器官概念擴大化參考：

上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）舉例：男性生殖器官解剖圖上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）舉例：ED010523灌胃20天后對去勢大鼠性器官

重量、臟器指數(shù)的影響（Mean

SD，N=10）

正常對照去勢模型組丙酸睪酮昔多酚ED1浸膏ED010523(mg/kg)

1.25(mg/kg)90(mg/kg)450(mg/kg)50100200體重（g）254.00±25.45270.00±9.09249.00±25.20255.00±32.73269.00±13.00260.50±11.27229.50±16.91236.50±14.80包皮腺（g）0.08±0.01*

0.06±0.020.10±0.02*

0.07±0.010.08±0.01*

0.07±0.010.07±0.010.08±0.01*

（臟器系數(shù)）0.03±0.000.01±0.000.02±0.010.03±0.010.03±0.000.03±0.000.03±0.000.03±0.01精液囊（g）0.59±0.17*

0.28±0.052.27±0.45*

0.22±0.040.51±0.23*

0.39±0.07*

0.52±0.17*

0.43±0.16*

（臟器系數(shù)）0.24±0.070.10±0.020.91±0.190.09±0.020.19±0.090.15±0.030.23±0.080.19±0.07前列腺（g）0.67±0.17*

0.21±0.040.69±0.13*

0.20±0.040.44±0.19*

0.38±0.10*

0.48±0.10*

0.58±0.18*

（臟器系數(shù)）0.28±0.080.08±0.020.28±0.070.08±0.030.16±0.070.15±0.040.21±0.030.25±0.08提肛?。╣）0.29±0.05*

0.16±0.040.25±0.08*

0.17±0.040.28±0.11*

0.27±0.11*

0.29±0.08*

0.25±0.11*

（臟器系數(shù)）0.12±0.050.06±0.010.10±0.030.07±0.020.10±0.040.11±0.040.13±0.040.11±0.05上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）（二）研究技術(shù)水平縱深化

傳統(tǒng)研究水平

現(xiàn)代研究水平一般生殖毒理學(xué)致畸敏感期毒性試驗圍產(chǎn)期毒性試驗組織病理學(xué)毒性研究細胞生物學(xué)毒性研究等一般生殖毒理學(xué)致畸敏感期毒性試驗圍產(chǎn)期毒性試驗組織病理學(xué)毒性研究細胞生物學(xué)毒性研究

分子毒理學(xué)研究基因毒理學(xué)研究

等M

：DNAMarkC：對照E1：100nM愛普列特E2：300nM愛普列特E3：1000nM愛普列特ME3E2E1C上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）舉例：愛普列特治療前列腺增生研究藥物影響B(tài)cl-2

基因電泳特征舉例：愛普列特作用于輸精管上皮細胞的研究

愛普列特對Bcl-2基因序列的影響上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）*注：Exp.1:標(biāo)本(PRO4);Exp.2:標(biāo)本(LN3)

轉(zhuǎn)移灶癌(LN3)與原發(fā)灶(PRO4)前列腺癌細胞的基因表達水平比較

上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）舉例：前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移后基因毒理學(xué)研究

基因芯片技術(shù)測定轉(zhuǎn)移后基因表達上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）（三）生殖毒性概念健康化傳統(tǒng)毒性概念現(xiàn)代健康概念高劑量毒性反應(yīng)化合物毒性效應(yīng)等

高劑量毒性反應(yīng)化合物毒性效應(yīng)化合物副反應(yīng)開發(fā)（昔多酚壯陽效應(yīng)）（舍曲林抗早泄作用）等舉例：舍曲林治療男性早泄藥效學(xué)研究

藥物對大鼠性功能的影響（

X

SD）

分組劑量(mg/kg)動物數(shù)（N）追逐次數(shù)（N）撲捉爬跨次數(shù)（N）射精潛伏期（S）潛伏期（min）次數(shù)（N）舍曲林384.75±2.2510.69±3.792.88±0.992.00±1.313.67±1.851094.22±1.7212.63±3.81*3.78±1.561.44±0.885.31±1.43*3075.43±1.9015.26±6.41*3.00±1.151.29±0.764.70±0.91*正常對照74.29±1.986.36±2.771.57±0.790.57±0.792.73±0.92*P<0.05vs

正常對照組上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）（四）生殖毒性研究功能化常規(guī)研究內(nèi)容擴大研究內(nèi)容注重器質(zhì)性毒性反應(yīng)等

注重器質(zhì)性毒性反應(yīng)注意到功能性毒性反應(yīng)等上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）常規(guī)研究內(nèi)容擴大研究內(nèi)容臟器重量及其系數(shù)測定（前列腺、精囊腺、包皮腺和提肛肌）組織病理學(xué)分析（前列腺、精囊腺、包皮腺和提肛?。┑?/p>

功能性深入研究

（陰莖勃起試驗）腺體分泌功能檢測

（體內(nèi)睪丸酮及雙氫睪丸酮水平測定）機制探討

（動物海綿體組織中cGMP水平測定）等舉例：中藥ED010523治療陽痿藥效學(xué)研究上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）（五）生殖毒性研究人群化傳統(tǒng)研究對象擴大研究內(nèi)容動物或人個體研究等

人群的流行病研究等等舉例：人群精子質(zhì)量調(diào)查研究

參考：李剛等.成都地區(qū)549例大學(xué)生精子質(zhì)量調(diào)查.中華男科學(xué)2003，9(9)：673-678.上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）（一）涉及的內(nèi)容面廣量大（二）文辭的表述嚴(yán)謹(jǐn)貼切（三）指標(biāo)的選擇具體詳實（四）技術(shù)的操作規(guī)范嚴(yán)格（五）研究的程度高深玄妙上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）二、新藥生殖毒性評價技術(shù)更加嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范舉例：新舊指南上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）（一）涉及的內(nèi)容面廣量大原有內(nèi)容現(xiàn)有內(nèi)容動物選擇劑量設(shè)計給藥時間給藥途徑觀察和報告等

動物選擇劑量設(shè)計給藥時間給藥途徑觀察和報告組織胚胎學(xué)內(nèi)容妊娠或哺乳動物的藥代動力學(xué)特定受試物的F2代生殖毒性等舉例：原有表述上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）舉例：現(xiàn)有表述（1）上海市計劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心）舉例：現(xiàn)有表述（