流式細胞術(shù)及其臨床應(yīng)用課件

流式細胞術(shù)原理及臨床應(yīng)用

流式細胞儀(FlowCytometer)是現(xiàn)代物理電子技術(shù)、激光技術(shù)、計算機技術(shù)以及細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器；當(dāng)細胞（或其他粒子）以單個方式依次通過探測光束時，能夠采集細胞被光照時產(chǎn)生的各種信號，然后對信號進行處理，并能對多個參數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析的一種儀器流式細胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM)利用流式細胞儀對處于快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)激光技術(shù)、計算機技術(shù)、顯微熒光技術(shù)、光電子技術(shù)、流體噴射技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、納米技術(shù)以及分子生物學(xué)和免疫學(xué)等多門學(xué)科知識現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的綜合交叉的產(chǎn)物，是集多種技術(shù)發(fā)展于一體的“大成者”廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)、腫瘤生物學(xué)和血液學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域20世紀70年代發(fā)展至今，儀器設(shè)備更趨完善，在應(yīng)用上也逐漸由基礎(chǔ)研究進入到臨床檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，為細胞分析提供全新手段1930

Caspersson&Thorell

細胞計數(shù)1940

Coons結(jié)合熒光素的抗體去標記細胞內(nèi)特定蛋白1934

Moldaven細胞檢測自動化光電儀記錄流過一根毛細管的細胞數(shù)

1949

WallaceCoulter懸液中計數(shù)粒子的方法并獲專利1950

Caspersson顯微分光光度計UV-VIS光譜區(qū)檢測細胞1953CroslanndTaylor根據(jù)分層鞘流原理成功設(shè)計紅細胞光學(xué)自動計數(shù)器1969

VanDilla及同事在LosAlamos,NM發(fā)明第一臺熒光檢測細胞計1972Herzenberg熒光激活細胞分選儀熒光標記抗體染色的細胞的較弱熒光信號1975

Kohler單克隆抗體為細胞研究提供大量的特異免疫試劑流式細胞術(shù)發(fā)展史1973BD公司與斯坦福大學(xué)合作第一臺商用流式細胞儀分析型流式細胞儀細胞樣本分析后最終進入廢液桶，不能回收利用分選型流式細胞儀既能流式分析，還能對分析的目的細胞進行分選；進樣管道較長，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流式細胞儀一般只用于分選流式細胞儀的分類計算機與分析系統(tǒng)信號收集與光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)流動室與液流系統(tǒng)光源與光學(xué)系統(tǒng)流式細胞儀構(gòu)造激發(fā)光源計算機分析濾光片流動室、鞘液和樣本流信號檢測器激發(fā)光源光學(xué)系統(tǒng)細胞分選與濃縮系統(tǒng)（一）流動室與液流系統(tǒng)流動室是流式儀核心部件，被測樣品在此與激光相交流動室由石英玻璃制成，中央有一長方形小孔，供單個細胞通過流動室內(nèi)充滿了鞘液，其作用是將樣品環(huán)形包繞鞘液流速穩(wěn)定，樣品流在鞘流的環(huán)包下形成流體動力學(xué)聚焦，從而得到準確的細胞熒光信息（一）流動室與液流系統(tǒng)液流驅(qū)動系統(tǒng)（二）激光光源與光學(xué)系統(tǒng)（一）激發(fā)光源：激光器

氣體激光器：氬離子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪離子

(647nm)、氪氬(568nm)；染料激光器：如氬離子激光器的泵浦含有Rhodomin6G水溶液染料，

發(fā)出550-650nm可變波長激發(fā)光；半導(dǎo)體激光器：價格低、結(jié)構(gòu)簡單、壽命長；BD的FACSCalibur已采用635nm半導(dǎo)體激光器激光特點：單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照（二）激光光源與光學(xué)系統(tǒng)（二）光束成行系統(tǒng)（二）激光光源與光學(xué)系統(tǒng)透鏡（二）光束成行系統(tǒng)濾光片的組成長通(Longpass，LP)濾片：只允許特定波長以上的光束通過短通(Shortpass，SP)濾片：只允許特定波長以下的光束通過帶通(Bandpass，BP)濾片：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過（二）激光光源與光學(xué)系統(tǒng)（三）光收集系統(tǒng)（二）激光光源與光學(xué)系統(tǒng)

480520

460500

540SP500LP500BP500/50（三）光收集系統(tǒng)480520460500

540480520

460500

540光信號的類型

散射光信號：與標記熒光素?zé)o關(guān)，是細胞的固有參數(shù)前向散射光(forwardscatter,FSC)側(cè)向散射光(sidescatter,SSC)

熒光信號自發(fā)熒光：微弱特異熒光：標記的熒光素分子發(fā)出

的熒光，比自發(fā)熒光強很多倍（三）信號收集和光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)（一）前向散射光FSCFSC信號方向與激光束平行，偏離度一般在1-6度范圍內(nèi)，亦稱小角度散射光，主要反映被測細胞的體積大?。ㄈ┬盘柺占凸怆娹D(zhuǎn)換系統(tǒng)（二）側(cè)向散射光SSCSSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號強度反映細胞內(nèi)部顆粒度和精細結(jié)構(gòu)的變化。（三）信號收集和光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)R1:淋巴細胞R2:單核細胞R3:中性粒細胞R4:裂解碎片（三）信號收集和光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)外周血裂紅后FSC/SSC分布（三）熒光信號熒光：物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光（三）信號收集和光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)基態(tài)（三）熒光信號細胞經(jīng)過特異熒光素標記后，受激發(fā)光照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測就能了解所研究細胞參數(shù)的存在與定量細胞抗原抗體熒光素激光束（三）信號收集和光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)（三）熒光信號常用熒光素（三）信號收集和光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)熒光素分子激發(fā)波長(nm)發(fā)射光波(nm)中文名FITC488525異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白PerCP488677多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物APC633/635660別藻藍蛋白PE-Cy5488670藻紅蛋白-花青素5PE-Cy7488755藻紅蛋白-花青素7PerCP-Cy5.5488710能量傳遞染料（三）熒光信號常用熒光素（三）信號收集和光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)能量傳遞染料(PE-Cy5

PE-Cy7PerCp-Cy5.5)用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，最終檢測第二熒光染料發(fā)射的特定熒光信號（三）熒光信號（三）信號收集和光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)<499nm：藍色熒光（Blue）500-549nm：綠色熒光（Green）550-584nm：黃色熒光（Yellow）585-615nm：橙色熒光（Orange）616-700nm：紅色熒光（Red）≥700nm：遠紅外熒光（Far-Red）（三）熒光信號（三）信號收集和光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)目前常用FCM配置（BDCalibar）488nm激光管常用染料有第一通道（FL1）：FITC(FluoresceinIsothiocyanate)第二通道（FL2）：PE(Phycorey-thrin)第三通道（FL3）：PerCP(PeridininChlorophyllProtein)PE-Cy7、PE-Cy5、

PerCP-Cy5.5633nm激光管常用染料有第四通道（FL4）：APC多色標記熒光素搭配原則

每個通道只能選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APCFL-AFL-HFL-W面積（A）：熒光總量高度（H）：最大熒光強度寬度（W）：細胞直徑光信號到電脈沖信號FACSCalibur流式細胞儀信號檢測系統(tǒng)（四）計算機和分析系統(tǒng)FCM數(shù)據(jù)顯示方式單參數(shù)直方圖(Histogram)雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示：散點圖(DotPlot)偽彩圖(Pseudo-colorPlot)等高線圖(ContourPlot)密度圖(DensityPlot)假三維圖(Pseudo3DPlot)三維圖(3DPlot)常用分析軟件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCSExpress直方圖（Histogram）細胞的某一單參數(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分布圖，橫坐標表示熒光信號或散射光信號相對強度的值，單位是道數(shù)，縱坐標一般是細胞數(shù)Event#FL1FITC11027003720415……0…………101…………102…………103CountsFITC熒光強度（四）計算機和分析系統(tǒng)直方圖（Histogram）（四）計算機和分析系統(tǒng)橫坐標既可以是線性的，也可以是對數(shù)的DNA倍體分析抗原表達分析Overlay圖散點圖(DotPlot)（四）計算機和分析系統(tǒng)散點圖中每個點代表一個細胞，X軸與Y軸分別代表一種參數(shù)，優(yōu)點是比直方圖直觀FL1FL2散點圖(DotPlot)（四）計算機和分析系統(tǒng)散點圖偽彩圖等高圖和等密度圖（四）計算機和分析系統(tǒng)等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細胞數(shù)目越多。密度圖：點密度越大的地方細胞越多，點密度越小的地方細胞少。（四）計算機和分析系統(tǒng)假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC→CD45→CD14→門(Gate，簡寫G)是流式細胞術(shù)中的一個重要術(shù)語，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)分析過程實際上就是選門和設(shè)門的過程橢圓形圓形設(shè)門與數(shù)據(jù)分析（四）計算機和分析系統(tǒng)矩形任意形狀R(Region，區(qū)域)：門可以是單一區(qū)域(G=R1)，也可以是幾個區(qū)域組合在一起：G=R1andR2;G=R1orR2;G=R1notR2（四）計算機和分析系統(tǒng)十字門線性門（四）計算機和分析系統(tǒng)流式細胞術(shù)的最大特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲得多種信號對細胞進行定量分析或純化分選細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量流式細胞儀特點目前國內(nèi)主要流式細胞儀廠家BecktonDickinson(BD)BACKMANCOULTEREpicsXL單激光四色，分析型CyAn三激光九色，分析型FC500單激光或雙激光五色，市場覆蓋率較高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分選型BeckmanCoulter公司流式細胞儀BD公司分析型流式細胞儀FACSCalibur雙激光四色，市場覆蓋率最高FACSCantoII雙激光六色，三激光八色FACSVerse雙激光六色，三激光八色AccuriC6雙激光四色BD公司分析型流式細胞儀LSRFortessa?X-20五激光十八色，分析型最高配LSRII雙激光六色，三激光八色，四激光十色FACSVantageSEFACSAriaIIIInfluxBD公司分選型流式細胞儀BDFACSCantoII

雙激光或三激光，8色分析八角形/三角形光信號接受系統(tǒng)，利用全反射的光路結(jié)構(gòu)設(shè)計，避免透射過程對光信號的損耗，提高熒光靈敏度兼顧科研需求和臨床檢測BDFACSTM7-colorsetupbeads使體外診斷中所有實驗的日常儀器設(shè)置在一管中進行專門配備有FACSCanto臨床軟件，淋巴細胞亞群，HLA-B27等臨床自動檢測和分析軟件，直接報告檢測結(jié)果獨立液流車系統(tǒng)，保持液流的穩(wěn)定最小樣本量：

30微升手動上樣/自動連續(xù)上樣獲得SFDA認證BDLSRFortessa?X-20提供5激光，18色分析18種波長的激光器，橫跨從紫外到紅外全光譜范圍，提供靈活的光譜選擇滿足高端科研需求淋巴細胞亞群HLA-B27CD55、CD59檢測CD34造血干細胞計數(shù)白血病和淋巴瘤免疫分型TH1/TH2細胞檢測血小板活化炎癥感染指標CD64網(wǎng)織紅細胞/血小板檢測微小殘留病灶（MRD）腫瘤細胞倍體（DNA）細胞凋亡……流式細胞術(shù)的臨床應(yīng)用標本的種類：血液、骨髓穿刺液、各種體液（胸水、腹水、腦脊液）、組織（如淋巴

結(jié)、肝、脾）及肺泡灌洗液等抗凝劑：外周血：EDTA、肝素和枸櫞酸均可骨髓：肝素（推薦）、EDTA血小板：枸櫞酸儲存時間：EDTA：24～48h

肝素：48～72h枸櫞酸：72h嚴重溶血、凝血或壞死的樣本應(yīng)棄用單細胞懸液標本要求淋巴細胞亞群分析試劑：BDMultitestIMKKit標本：外周血（常用）配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC

CD3-FITC/CD19-PE/CD45-PerCP/CD16CD56-APC檢測指標：T細胞（CD3+CD4+、CD3+CD8-）

B細胞（CD19）

NK細胞（CD3-CD16＋56＋）臨床意義——反應(yīng)體內(nèi)免疫狀態(tài)CD4+T降低：病毒感染、惡性腫瘤、免疫缺陷病、免疫抑制劑使用CD8+T增高：病毒及結(jié)核桿菌感染，自身免疫性疾病活動期、腫瘤、慢性活動性肝炎CD4/CD8降低：

處于免疫抑制狀態(tài)免疫缺陷?。喝绨滩r的比值常顯著小于0.5某些惡性腫瘤：如肝癌、食道癌、肺癌、膀胱癌等某些病毒感染：HBV、EB、CMV等NK細胞（CD3—CD16+和/或CD56+）能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的細胞毒性作用

淋巴細胞亞群分析淋巴細胞亞群分析HIV感染者HLA-B27檢測試劑：BDHLA-B27Kit標本：外周血檢測指標：T

(CD3+)淋巴細胞上HLA-B27定性檢測臨床意義：

強直性脊柱炎（高度相關(guān)，90%）Reiter’s綜合征（70-90%）銀屑病關(guān)節(jié)炎（50-60%）

急性前葡萄膜炎（40-50%）HLA-B27檢測PNH診斷試劑：CD59-FITC、CD55-PE標本：外周血檢測指標：CD55、CD59百分比

CD55、CD59熒光強度陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）的發(fā)病機制為X染色體上的PIG-A基因發(fā)生突變，引起糖化肌醇脂（GPI）錨合成障礙，使GPI錨連蛋白缺乏，已證實的GPI錨連蛋白有10余種，用于PNH診斷的主要為CD55和CD59兩種，如果在紅細胞上出現(xiàn)CD55或/和CD59的減少，可診斷為PNHNormalPNHPNH診斷造血干細胞計數(shù)試劑：BDProcount?ProgenitorCell

EnumerationKit標本：骨髓、動員后的外周血配色：CD34-PE、CD45-PerCP、nucleicaciddye檢測指標：CD34＋％及濃度藍色－熒光微球（數(shù)量已知）；紅色－CD34＋細胞干細胞特征：

CD45表達弱→陰性(R2)CD34表達弱→強(R4)DNA/RNA含量多，染色性較強(R1)大?。‵SC）和顆粒度（SSC）淋巴細胞相似臨床意義：

血液系統(tǒng)疾病的造血干細胞移植

數(shù)量的檢測

采集時機的確定

造血干細胞計數(shù)白血病和淋巴瘤免疫分型試劑：各種單克隆熒光抗體標本：骨髓、外周血、胸腹水、腦脊液、淋巴組織分型方案：CD45設(shè)門，四色標記，臨床意義：

客觀、快速地分析

確定異常細胞系來源及分化階段判斷預(yù)后白血病和淋巴瘤免疫分型正常骨髓細胞CD45/SSCR1:淋巴細胞R2:幼稚細胞R3:單核細胞R4:中性粒細胞R5:有核紅細胞AML-M1R2占94％，表達CD33,CD34,CD117,CD71,CD13,CD64,MPOALL(B)R2占65％，表達CD79a,CD19,CD34,CD22,CD10,CD38