PTIO和ABTS自由基清除實驗操作指南-李熙燦-曾婧媛

PTIO和ABTS自由基的清除實驗操作指南（以槲皮素為例）【前言】PTIO和ABTS自由基簡介PTIO是與人體內自由基較為相似的氧自由基;而ABTS是氮自由基，雖然主要元素不同，但它們都較為穩(wěn)定且隨著被清除都會造成在特定波長下吸光度減小，所以常被用于檢測物質體外抗氧化能力強弱。本文詳細介紹了這兩種自由基清除實驗的操作方法，并附有實例。其中，PTIO自由基可以用于檢測活性氧的清除能力；而ABTS自由基則適于檢測活性氮的的清除能力。（A）（B）（C）（D）圖1.（A）PTIO自由基結構式（B）ABTS自由基結構式（C）PTIO分子模型（不同角度）（D）ABTS分子模型（不同角度）（采用Chem3DPro14.0軟件繪制）【實驗方法】1.PTIO自由基清除[1]1.1溶液的配置PTIO試液：3mgPTIO固體+20mL甲醇超聲，混勻PTIO測試液取80LPTIO測試液和20mL甲醇（與PTIO測試液中溶劑一致）混勻，在557nm處測定吸光度，使吸光度保持在0.350.01之間。吸光度偏大或偏小，就調節(jié)原PTIO測試液的濃度，使吸光度保持為0.350.01。此吸光度為A0。樣品液：用合適溶劑溶解（一般為95乙醇或水），先配置成10mg/mL的溶液，可適當超聲使之完全溶解，混合均勻。1.2預實驗取80mL的PTIO試液，往其中加少量樣品液，加樣時，緩慢少量加入，邊加邊混合，并觀察溶液褪色情況，當溶液剛剛好褪色完全，記下此時樣品的加樣量。此加樣量即為樣品最大加樣量，在此最大用量基礎上，往前設置5個用量使之成為等差數(shù)列。（如，如果最大加樣量為20mL，那么對于該樣品而言，其用量梯度宜設為0mL、4mL、8mL、12mL、16mL、20mL）注意事項：預實驗中可能會遇到樣品最大加樣量很?。ǖ陀?0mL），此時應該降低原樣品液的濃度，再做預實驗。如果最大加樣量低于10mL，可能不會得到很好的量效關系曲線。預實驗中也可能會遇到樣品最大加樣量很大（大于20mL），或者不能立即褪色，此時可以將溶液37℃水浴2小時后再觀察，若褪色效果仍不明顯，應加大原樣品液濃度再做預實驗。1.3A值測量用移液槍取PTIO試液80mL加入到96孔板，加樣品液xmL（x是根據(jù)1.2預實驗確定的樣品用量），再加（20-x）mL甲醇混合，37℃水浴30分鐘后，測定A值（560nm）如：某樣品用量梯度為0（測出的值為A0值）、4、8、12、16、20mL，則加樣表如下：表1.加樣表樣品液甲醇PTIO試液總體積0mL20mL80mL100mL4mL16mL80mL100mL8mL12mL80mL100mL12mL8mL80mL100mL16mL4mL80mL100mL20mL0mL80mL100mL正式實驗時，每個用量需要測3個以上的平行數(shù)據(jù)，以避免誤差1.4數(shù)據(jù)處理PTIO自由基清除率的計算：清除率=（1-A/A0）*100清除率計算出來以后，可以做出量效關系的曲線，然后通過線性方程計算其樣品的IC50。1.5實例（槲皮素PTIO清除能力測定）首先，我們通過預實驗，確定了合適的槲皮素樣品濃度（1mg/mL），及其用量，加樣表如下。表2.槲皮素(1mg/mL)加樣表槲皮素（mL）95乙醇（mL）PTIO試液(mL)總體積（mL）0208010021880100416801006148010081280100101080100同一個用量測定三組平行數(shù)據(jù)，所得到的實驗結果如下表。表3.槲皮素吸光度槲皮素用量（mL）槲皮素實際吸光度（=槲皮素吸光度-空白對照組吸光度）平均吸光度00.3640.3640.3530.36020.2340.2370.2470.23940.1840.1980.1880.19060.1430.1360.1360.13880.1100.0970.1080.105100.0560.0630.0510.057然后，我們通過PTIO清除率的計算公式：清除率=（1-A/A0）*100，計算出槲皮素的清除率并作出量效曲線。如下圖表。表4.槲皮素相對清除率槲皮素用量（mL）槲皮素用量（mg/mL）相對清除率1相對清除率2相對清除率300///22035.0034.1731.3944048.8945.0047.7866060.2862.2262.2288069.4473.0670.001010084.4482.5085.83圖2.槲皮素的量效曲線及其線性方程（可用Excel軟件、Origin軟件作圖）通過其量效曲線及其線性方程，我們可以計算出槲皮素的IC50值，用以判斷槲皮素清除PTIO能力強弱。表5.槲皮素的IC50值LINKExcel.Sheet.12C:\\Users\\春酒\\Desktop\\有機化學實驗\\實驗數(shù)據(jù)\\曾婧媛\\槲皮素2019\\實驗表格\\PTIO.xlsxSheet1!R24C26:R27C28\a\f5\hIC50ug/ml平均IC50ug/mlSD相對清除率143.9144.560.57相對清除率244.95相對清除率344.842.ABTS+自由基清除實驗[2]2.1溶液的配置ABTS儲備液（7.4mM）：取ABTS3mg，加蒸餾水1.48mL。K2S2O8儲備液（2.6mM）：取K2S2O82mg，加蒸餾水2.8mL。ABTS工作液：取ABTS儲備液0.2mL和K2S2O80.2mL，混合，在黑暗室溫環(huán)境內放置12小時，用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋10-20倍（也可以用95乙醇或甲醇），取80mL此溶液和20mL95乙醇混合，在734nm下測定吸光度，吸光度應為0.30.01。樣品溶液：用合適溶劑溶解（一般為95乙醇或水），先配置成10mg/mL的溶液，可適當超聲使之完全溶解，混合均勻。2.2預實驗基本與1.2預實驗部分一樣，區(qū)別在于在734nm下測定吸光度。2.3A值測量基本操作與1.3A值測量部分一樣。但是PTIO試液換成ABTS工作液，甲醇換成ABTS工作液中用于稀釋的溶劑（如果用95乙醇稀釋，這里加入的就是95乙醇），在734nm下測定吸光度。正式實驗時，每個用量同樣是測定三個以上平行數(shù)據(jù)，以避免誤差。2.4數(shù)據(jù)處理ABTS自由基清除率=（1-A/A0）*100清除率計算出來以后，可以做出量效關系的曲線，然后通過線性方程計算其樣品的IC50。2.5實例（抗壞血酸）首先，我們通過預實驗，確定了合適的抗壞血酸濃度（0.1mg/mL），及其用量，加樣表如下。表6.抗壞血酸（0.1mg/mL）加樣表抗壞血酸（mL）95乙醇（mL）PTIO試液(mL)總體積（mL）020801003178010061480100911801001288010015580100同一個用量測定三組平行數(shù)據(jù)，所得到的實驗結果如下表。表7.抗壞血酸吸光度的測量結果抗壞血酸用量（mL）抗壞血酸實際吸光度（=抗壞血酸吸光度-空白對照組吸光度）平均吸光度12300.3120.3330.3290.32530.2430.2380.2460.24260.1850.1860.1760.18290.1360.1570.1280.140120.0540.0570.0460.052150.0070.0280.0060.014然后，我們通過ABTS清除率的計算公式：清除率=（1-A/A0）*100，計算出抗壞血酸的清除率并作出量效曲線。如下圖表。表8.抗壞血酸相對清除率抗壞血酸用量（mL）抗壞血酸用量（mg/mL）相對清除率1相對清除率2相對清除率300///3325.2326.7724.316643.0842.7845.859958.1551.6960.62121283.3882.4685.85151597.8591.3898.15圖3.抗壞血酸的量效曲線及其線性方程（可用Excel軟件、Origin軟件作圖）通過其量效曲線及其線性方程，我們可以計算出抗壞血酸的IC50值，用以判斷抗壞血酸清除ABTS自由基能力強弱表9.抗壞血酸的IC50值LINKExcel.Sheet.12C:\\Users\\春酒\\Desktop\\有機化學實驗\\實驗數(shù)據(jù)\\曾婧媛\\槲皮素2019\\實驗表格\\PTIO.xlsxSheet1!R24C26:R27C28\a\f5\hIC50ug/ml平均IC50ug/mlSD相對清除率17.137.150.24相對清除率27.40相對清除率36.93【參考文獻】[1]XicanLi.2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-oxide(PTIO?)Radical-scavenging:ANewandSimpleAntioxidant.JournalofAgricultural&FoodChemistry.2017，65,6288?6297；[2]XicanLi,TingtingWang,JingjingLiu,Yulon