飼料中阪崎腸桿菌活菌的檢測EMA

《飼料中阪崎腸桿菌活菌的檢測EMA-PCR法》河南省地方標(biāo)準(zhǔn)編制說明一、編制的目的和意義阪崎腸桿菌(Enterobactersakazaii )是一種革蘭氏陰性、周生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、無芽孢的兼性厭氧細(xì)菌，屬條件性致病菌。自1961年，英國首次報(bào)道2例由阪崎腸桿菌引起的腦膜炎病例以來，相繼在美國、加拿大、比利時(shí)等國家報(bào)道了新生兒阪崎腸桿菌感染事件。國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(ICMSF)在2002年將阪崎腸桿菌列為“嚴(yán)重危害特定人群生命、引起長期慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥的一種致病菌”。阪崎腸桿菌能引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥，并且可能引起神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥和死亡，在某些情況下，由阪崎腸桿菌引發(fā)疾病而導(dǎo)致的死亡率可達(dá)40%?80%。因此，對(duì)阪崎腸桿菌活菌建立快速、特異、靈敏的檢測標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于該菌的早期發(fā)現(xiàn)及傳播的有效控制至關(guān)重要。目前阪崎腸桿菌的檢測方法較多，主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)方法。我國目前采用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法，檢測時(shí)間需要一周左右，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；分子生物學(xué)方法雖然快速，靈敏，但不能區(qū)分死菌與活菌，而死菌DNA的存在容易導(dǎo)致假陽性問題。本研究以阪崎腸桿菌16SrDNA保守序列為靶基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，采用EMA與PCR結(jié)合的方法進(jìn)行檢測，能夠有效地區(qū)分阪崎腸桿菌的死菌與活菌避免了因死菌DNA存在造成的假陽性結(jié)果,同時(shí)減去了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法中目標(biāo)菌分離純化的步驟，節(jié)約了大量檢測時(shí)間。本次研究結(jié)果顯示，PCR檢測阪崎腸桿菌的靈敏度在1.0X102cfu/mL左右，從樣品處理、預(yù)增菌、PCR擴(kuò)增、凝膠電泳只需要48h左右，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于檢測飼料中阪崎腸桿菌的污染狀況，對(duì)飼料的安全監(jiān)測具有重大意義。二、任務(wù)來源及編制原則和依據(jù)1、任務(wù)來源根據(jù)河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局文件《河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局關(guān)于下達(dá)2017年第一批河南省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》（豫質(zhì)監(jiān)標(biāo)發(fā)〔2017〕104號(hào)）的要求，由河南省獸藥飼料監(jiān)察所負(fù)責(zé)對(duì)河南省地方標(biāo)準(zhǔn)《飼料中阪崎腸桿菌活菌的檢測EMA-PCR法》（立項(xiàng)編號(hào)：20171210482）的起草、制定工作。2、編制原則符合國家法律、法規(guī)和政策，本著嚴(yán)格遵循科學(xué)依據(jù)，與國際水平接軌，并且準(zhǔn)確、實(shí)用、快速的原則，開展了本次研究工作。3、編制依據(jù)主要依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)：GB4789.40-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)；GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求；GB4789.28食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求。三、編制過程標(biāo)準(zhǔn)的編制過程分三個(gè)階段進(jìn)行：第一階段：阪崎腸桿菌活菌EMA-PCR檢測方法的建立引物設(shè)計(jì)根據(jù)阪崎腸桿菌16SrDNA設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。根據(jù)該基因中的保守且特異性序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增932bp大小的特異性引物對(duì)。表1引物序列引物序列片段大小上游5'-CTGCTCTGCTGACGAGTGG-3'932bp下游5'-CATCTCTGCAGGATTCTCTGGA-3'EMA-PCR方法參數(shù)的優(yōu)化首先是探索阪崎腸桿菌培養(yǎng)物的最佳致死方法和EMA最佳終濃度，分別采用煮沸裂解、紫外照射及化學(xué)方法對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行處理，再分別加入EMA，制備成EMA終濃度成梯度變化的菌懸液,采用鹵素?zé)暨M(jìn)行光照交聯(lián)。然后通過離心收集上清液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀察凝膠電泳結(jié)果，選出最優(yōu)的致死方法和最佳EMA添加終濃度。其次是最佳曝光時(shí)間的確定，在上述試驗(yàn)的結(jié)果上，選出最優(yōu)組合，采用鹵素?zé)粝路謩e照射0、1、2、4、6、8、lOmin,離心收集上清液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。確定方法的靈敏度和特異性。用建立的阪崎腸桿菌EMA-PCR方法檢測飼料及飼料原料樣品，并與GB4789.40克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)比對(duì),以驗(yàn)證該方法的實(shí)用性和準(zhǔn)確性。第二階段：阪崎腸桿菌EMA-PCR檢測方法應(yīng)用實(shí)驗(yàn)本階段主要進(jìn)行阪崎腸桿菌EMA-PCR檢測方法在河南省范圍內(nèi)的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所建立的診斷方法的特異性、敏感性和實(shí)用性，由河南省獸藥飼料監(jiān)察所進(jìn)行飼料樣品檢測應(yīng)用試驗(yàn)。共對(duì)來自全國4個(gè)省（大部分樣品來自河南?。┕灿?jì)216批飼料及飼料原料樣品進(jìn)行了應(yīng)用檢測；共檢測出1批阪崎腸桿菌陽性樣品，并對(duì)阪崎腸桿菌進(jìn)行了分離鑒定。同時(shí)與GB4789.40《克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)》進(jìn)行了對(duì)比，檢測結(jié)果顯示，EMA-PCR方法檢測結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法GB4789.40檢測結(jié)果完全一致，但檢測時(shí)間比傳統(tǒng)培養(yǎng)法縮短了2-3天的時(shí)間。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，EMA-PCR方法具有準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，在應(yīng)用推廣方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。第三階段：標(biāo)準(zhǔn)的起草、修改與制定根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)資料及所有參與實(shí)驗(yàn)人員意見，在系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)、科學(xué)分析的基礎(chǔ)上，組織有關(guān)專家起草了《飼料中阪崎腸桿菌活菌的檢測EMA-PCR法》河南省地方標(biāo)準(zhǔn)草案，規(guī)定了適用范圍、樣品處理方法、實(shí)驗(yàn)操作方法、結(jié)果判定等，并將標(biāo)準(zhǔn)草案送微生物有關(guān)方面專家征求意見，按照專家意見對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行多次修改完善，制定了當(dāng)前的《飼料中阪崎腸桿菌活菌的檢測EMA-PCR法（草案）》。項(xiàng)目主持人：吳志明，河南省獸藥飼料監(jiān)察所，主持本項(xiàng)地方標(biāo)準(zhǔn)的制定與編寫。主要起草人：高延玲：河南省獸藥飼料監(jiān)察所，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定和技術(shù)推廣。方忠意：河南省獸藥飼料監(jiān)察所，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定和檢測方法的優(yōu)化。董鵬：河南省獸藥飼料監(jiān)察所，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定、校訂和檢測方法的建立。李金磊：河南省獸藥飼料監(jiān)察所，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定、校訂和檢測方法的建立。狄元冉：河南省獸藥飼料監(jiān)察所，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定、校訂和優(yōu)化。四、主要內(nèi)容的確定檢測方法基本原理EMA能夠穿過死細(xì)菌的細(xì)胞膜，在強(qiáng)光照射下可與其基因組DNA發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)合，使死細(xì)菌和游離狀態(tài)的DNA不能作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)阪崎腸桿菌的16SrDNA基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過對(duì)樣品進(jìn)行EMA處理然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析，含阪崎腸桿菌活菌的樣品會(huì)在932bp處出現(xiàn)一條目的條帶，而含有阪崎腸桿菌死菌及非阪崎腸桿菌的樣品不會(huì)出現(xiàn)該條帶。最佳致死方法、EMA濃度及曝光時(shí)間向煮沸致死、紫外處理和異丙醇處理后的0.5麥?zhǔn)蠁挝?MCF)阪崎腸桿菌菌懸液中分別加入EMA，使其終濃度分別為0、0.5、1、2、4、 8ug/mL,PCR結(jié)果電泳圖分別為圖1,圖2,圖3。由圖可以看出煮沸法致死效果最理想，加入EMA終濃度為0.5ug/mL既能完全抑制0.5MCF阪崎腸桿菌死菌的擴(kuò)增。另向0.5MCF活菌菌懸液加入EMA，使其終濃度分別為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18ug/mL，PCR電泳結(jié)果如圖4。由圖可以看出加入終濃度為8ug/mL的EMA樣品PCR電泳條仍無明顯減弱,表明終濃度W8ug/mL的EMA添加量不會(huì)抑制阪崎腸桿菌活菌的擴(kuò)增。lOflO——750 SCClOflO——750 SCC——250——100'—M1 2 3 4 5 6 7圖1煮沸處理注：M：Marker；1：陰性對(duì)照；2：0口g/mLEMA；3：0.5口g/mLEMA；4：1口g/mL

EMA；5：2口g/mLEMA；6：4口g/mLEMA；7:8口g/mLEMAbp200D1000750500250100圖2紫外照射處理注：M：Marker；1：陰性對(duì)照；2：0口g/mLEMA；3：0.5口g/mLEMA；4：1口g/mL

EMA；5：2口g/mLEMA；6：4口g/mLEMA；7:8口g/mLEMA

2D0010002D007505盹250100圖3異丙醇處理注：M：Marker；1：陰性對(duì)照；2：0口g/mLEMA；3：0.5口g/mLEMA；4：1口g/mL

EMA；5：2口g/mLEMA；6：4口g/mLEMA；7:8口圖3異丙醇處理200010002000750500250100M25 67S9 10 11圖4EMA抑制阪崎腸桿菌活菌濃度注：M：Marker；1：陰性對(duì)照；2：0口g/mLEMA；3：2ug/mLEMA；4：4口g/mLEMA；

5：6ug/mLEMA；6：8ug/mLEMA；7:M25 67S9 10 11圖4EMA抑制阪崎腸桿菌活菌濃度9：14ug/mLEMA；10：16ug/mLEMA；11：18ug/mLEMA向煮沸致死0.5MCF的阪崎腸桿菌菌懸液中加入EMA,使其終濃度為0.5ug/mL，黑暗環(huán)境下孵育5min后，分別曝光0、1、2、4、6、8、10min,處理后PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出只有不曝光的有條帶，其他均無條帶，說明EMA處理后，曝光1min，即可使EMA與死菌充分交聯(lián)。

bp20001000750bp20001000750500250100圖5曝光時(shí)間注：M：Marker；1:0min；2：1min；3：2min；4：4min；5：6min；6：8min；

7:10min；8：陰性對(duì)照PCR方法的敏感性用滅菌棉簽蘸取新鮮培養(yǎng)的營養(yǎng)瓊脂固體平板上的阪崎腸桿菌菌落轉(zhuǎn)接于5mL滅菌去離子水中，用比濁儀調(diào)至0.5MCF,系列稀釋至10-1-10-8，以此為模板，按上述方法進(jìn)行EMA-PCR試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)檢出的最低稀釋度進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37培養(yǎng)24h,檢測PCR反應(yīng)靈敏度。結(jié)果表明，建立的PCR方法檢測限是1.0X102cfu/mL（圖6）。2000100075020001000750500250103M1234567S9圖6PCR敏感性檢測注：M：Marker；1：陰性對(duì)照；2：10sCFU；3：107CFU；4：106CFU；5：105CFU；6：104CFU；7：103CFU；8：102CFU；9：10CFU；10：1CFUPCR方法的特異性將阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及其余待測菌株單菌落分別接種于LB肉湯中過夜培養(yǎng)，取菌液作為PCR反應(yīng)模板，按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果如圖7,由圖可以看出以阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為模板PCR產(chǎn)物出現(xiàn)有1條特異性的932bp條帶，與預(yù)測序列片段大小相符；陰性對(duì)照、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸桿菌等12株非阪崎腸桿菌菌株未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶；同時(shí)也未發(fā)現(xiàn)有其他非特異性擴(kuò)增條帶，表明建立的PCR方法具有很高的特異性。20001000750S002501QQ20001000750S002501QQM1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14圖7PCR特異性注：M：Marker；1：阪崎腸桿菌ATCC295442：陰性對(duì)照；3：甲型副傷寒沙門氏菌；4：鼠傷寒沙門氏菌；5：豬霍沙門氏菌；6：腸炎沙門氏菌；7：志賀氏菌；8：福氏志賀氏菌；9：宋內(nèi)氏志賀氏菌；10：鮑氏志賀氏菌；11：金黃色葡萄球菌；12:大腸桿菌；13:單增李斯特氏菌；14：腸致病性大腸桿菌5?結(jié)果報(bào)告凡被檢樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果在932bp處出現(xiàn)一條目的條帶（見圖8）,即可報(bào)告該樣品中檢出阪崎腸桿菌。bp20001000750500250100圖8阪崎腸桿菌活菌