生化鑒定原理知識分享

致病菌檢測生化鑒定原理及應(yīng)用三糖鐵瓊脂試驗靛基質(zhì)試驗ONPG試驗甲基紅MR試驗VP試驗?zāi)蛩孛冈囼炠嚢彼崦摿u酶試驗淀粉水解酶試驗?zāi)懼呷~苷水解試驗糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗甘油復(fù)紅試驗葡萄糖酸氧化試驗氧化發(fā)酵試驗枸櫞酸鹽利用試驗呼吸酶類試驗硝酸鹽還原試驗三糖鐵瓊脂試驗本培養(yǎng)基適合于腸桿菌科的鑒定。用于觀察細(xì)菌對糖的利用和硫化氫（變黑）的產(chǎn)生。該培養(yǎng)基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例為10:10:1，只能利用葡萄糖的細(xì)菌，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。而發(fā)酵乳糖的細(xì)菌(e.coli)，則產(chǎn)生大量的酸，使整個培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色。如培養(yǎng)基接種后產(chǎn)生黑色沉淀，是因為某些細(xì)菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng)，生成黑色的硫化亞鐵沉淀。三糖鐵瓊脂試驗

志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生H2S。

大腸桿菌，能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳糖，不產(chǎn)生H2S。

沙門氏菌，能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，大多數(shù)產(chǎn)生H2S，多數(shù)產(chǎn)氣。靛基質(zhì)試驗?zāi)承┘?xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)），當(dāng)加入吲哚試劑（對位二甲氨基苯甲醛）后則形成紅色的玫瑰吲哚。甲基紅（MR）試驗原理：某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培養(yǎng)基pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑呈紅色。如細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)（如醇、醛、酮、氣體和水），培養(yǎng)基pH在5.4以上，加入甲基紅指示劑呈桔黃色。應(yīng)用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性。VP試驗原理：測定細(xì)菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力。某些細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步脫羧形成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進(jìn)而與培養(yǎng)基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結(jié)合形成紅色化合物。即V-P試驗陽性。應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本試驗常與MR試驗一起使用，一般情況下，前者為陽性的細(xì)菌，后者常為陰性，反之亦然。但腸桿菌科細(xì)菌不一定都這樣規(guī)律，如蜂房哈夫尼亞菌和奇異變形桿菌的VP試驗和MR試驗常同為陽性。尿素酶試驗原理：某些細(xì)菌具有尿素酶，在含有尿素的培養(yǎng)基中，分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基呈堿性，此時培養(yǎng)基中的酚紅指示劑顯紅色。賴氨酸脫羥試驗賴氨酸脫酸主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定，也可用于某些非發(fā)酵菌。試驗關(guān)培養(yǎng)基中含有賴氨酸和葡萄糖，酸堿指示劑為溴甲酚紫（中性和堿性時紫色，酸性黃色），未用時為紫色。如果待測細(xì)菌將賴氨酸脫羧，則產(chǎn)生胺，為堿性，溴甲酚紫保持紫色，如果不脫羧，腸桿菌科的細(xì)菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸，溴甲酚紫變?yōu)辄S色。

氨基酸脫羧的對照管其實就是一個葡萄糖發(fā)酵管，不含氨基酸。由于實驗結(jié)果陽性的為保持紫色不變，陰性結(jié)果為黃色，為保證結(jié)果的可靠性，須同時接種對照管，如對照管變?yōu)辄S色，說明細(xì)菌接種成功，證實試驗管紫色（不變色）卻為陽性，而非未接種好細(xì)菌。

此外，由于氨基酸脫羧的產(chǎn)物為尸胺、腐胺等，遇氧不穩(wěn)定，故各管接種完細(xì)菌后，需加入幾滴液體石蠟隔絕空氣，保持胺的穩(wěn)定性。淀粉水解試驗原理：產(chǎn)生淀粉酶的細(xì)菌能將淀粉水解為糖類，在培養(yǎng)基上滴加碘液時，可在菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)。應(yīng)用：用于白喉棒狀桿菌生物型的分型，重型淀粉水解試驗陽性，輕、中型陰性；芽胞桿菌屬菌種和厭氧菌某些種的鑒定。膽汁七葉苷水解試驗原理：在10%~40％膽汁存在下，測定細(xì)菌水解七葉苷的能力。七葉苷被細(xì)菌分解生成的七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物。應(yīng)用：主要用于鑒別D群鏈球菌與其它鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如脆弱擬桿菌等）的初步鑒別。D群鏈球菌本試驗為陽性。糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗原理：不同種類細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖（醇、苷）類的酶，因而對各種糖（醇、苷）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、苷）類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而異。檢查細(xì)菌對培養(yǎng)基中所含糖（醇、苷）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用以鑒定細(xì)菌種類。

應(yīng)用：糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗，是鑒定細(xì)菌的生化反應(yīng)試驗中最主要的試驗，不同細(xì)菌可發(fā)酵不同的糖（醇、苷）類，如沙門菌可發(fā)酵葡萄糖，但不能發(fā)酵乳糖，大腸埃希菌則可發(fā)酵葡萄糖和乳糖。即便是兩種細(xì)菌均可發(fā)酵同一種糖類，其發(fā)酵結(jié)果也不盡相同，如志賀菌和大腸埃希菌均可發(fā)酵葡萄糖，但前者僅產(chǎn)酸，而后者則產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，故可利用此試驗鑒別細(xì)菌。甘油復(fù)紅試驗原理：甘油可被細(xì)菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脫去羧基為乙醛，乙醛與無色的復(fù)紅生成醌式化合物，呈深紫紅色。應(yīng)用：主要用于沙門菌屬內(nèi)各菌種間的鑒別。傷寒沙門菌、甲（丙）型副傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、孔道夫沙門菌和仙臺沙門菌本試驗為陰性，乙型副傷寒沙門菌結(jié)果不定，其它不常見沙門菌多數(shù)為陽性。葡萄糖酸氧化試驗原理：某些細(xì)菌可氧化葡萄糖酸鉀，生成α-酮基葡萄糖酸。α-酮基葡萄糖酸是一種還原性物質(zhì)，可與班氏試劑起反應(yīng)，出現(xiàn)棕色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。應(yīng)用：主要用于假單胞菌的鑒定和腸桿菌科菌分群。氧化發(fā)酵試驗原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；能進(jìn)行無氧降解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細(xì)菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細(xì)菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖，而氧化型細(xì)菌在無氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖。本試驗又稱氧化發(fā)酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）試驗，可用于區(qū)別細(xì)菌的代謝類型。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與其它非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細(xì)菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球菌（氧化型）。枸櫞酸鹽利用試驗原理：

枸櫞酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中枸櫞酸鈉為碳的唯一來源，磷酸二氫銨是氮的唯一來源。

有的細(xì)菌能利用枸櫞酸鈉為碳源，能在培養(yǎng)基上生長，并且能分解枸櫞酸鹽，最后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。

培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。

不能利用枸櫞酸鹽為碳源的細(xì)菌在該培養(yǎng)基上不生長，培養(yǎng)基不變色。

呼吸酶類試驗氧化酶試驗

原理：某些細(xì)菌具有氧化酶，能將二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺試劑氧化（先使細(xì)胞色素C氧化，電子傳遞體）成紅色醌類化合物。該實驗用于分辨革蘭氏陰性桿菌中的腸桿菌科（陰性）與弧菌科（陽性）。觸酶活力試驗

原理：具有觸酶的細(xì)菌能催化過氧化酶，放出生態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。

方法：取3%過氧化氫0.5ml，滴加到不含血液的被檢細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)物上，或滴加到不含血液的肉湯培養(yǎng)物中，觀察結(jié)果。

結(jié)果：培養(yǎng)物出現(xiàn)氣泡者為陽性。硝酸鹽還原試驗原理：某些細(xì)菌能將培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝