從乳糖酶不耐受到酶的固定化

從乳糖酶不耐受到酶的固定化指導老師：xxx：-1乳糖酶的介紹2乳糖酶的調控3重點！4乳糖酶的固定從乳糖酶不耐受到酶的固定化乳糖酶的介紹很多人由于小腸上皮細胞乳糖酶缺乏，飲用牛奶后乳糖不能被分解吸收，乳糖進入結腸后，被腸道細菌分解，產(chǎn)生大量乳酸、甲酸等短鏈脂肪酸和氫氣，造成滲透壓升高，使腸腔中的水分增多，引起腹脹、腸鳴、腸絞痛直至腹瀉等現(xiàn)象，這在醫(yī)學上稱為乳糖不耐癥(lactoseintolerance，LI)乳糖不耐癥與乳糖吸收不良合稱為乳糖酶缺乏(lactasedeficiency，LD)。乳糖酶缺乏是一種廣泛存在的世界性問題，影響了全世界近2/3的人口，亞洲患病率高達95%，LD對人類的健康造成很大的威脅，尤其是青少年人體腸道乳糖酶的來源主要是靠機體自身合成、腸道內益生菌的少量合成并分泌和服用外源乳糖酶補充乳糖酶的調控乳糖酶的調控腸道乳糖酶缺乏癥因為是基因原因導致，目前沒有根治的方法。因此腸道乳糖酶的調控技術顯得格外重要。腸道乳糖酶的調控技術主要有以下幾類第一類:積極治療原發(fā)病，避免使用損害乳糖酶活性的藥物禁止濫用抗生素，不恰當?shù)厥褂每股啬芤种普５囊嫔悍敝常恋K腸道微生物對乳糖的代謝作用，從而加重乳糖不耐受癥狀。促進腸上皮細胞修復及乳糖酶活性的恢復，如補充葉酸、鋅制劑等。此類方法主要是針對小腸黏膜彌漫性病變引起的繼發(fā)性乳糖酶缺乏癥第二類:已有研究表明某些中藥復方能夠治療腹瀉，其原因是增強了乳糖酶的活性張曉利等通過研究白頭翁復方對腹瀉小鼠腸道黏膜乳糖酶活性的影響，研究說明白頭翁復方能夠顯著增強腹瀉小鼠腸道黏膜上乳糖酶的活性，表明白頭翁復方治療腹瀉的作用機制可能與調節(jié)乳糖酶的活性有關乳糖酶的調控第三類:直接補充乳糖酶和生產(chǎn)低乳糖制品口服外源性的乳糖酶和用乳糖酶水解乳糖來生產(chǎn)低乳糖或無乳糖乳制品以輔助乳糖消化吸收是目前廣泛關注的研究熱點某些細菌、酵母菌和真菌也能合成乳糖酶目前，國際市場的乳糖酶產(chǎn)品，一種是乳酸克魯維酵母制備的乳糖酶，另一種是米曲霉制備的真菌乳糖酶比較成熟的是乳酸克魯維酵母發(fā)酵的乳糖酶，這種乳酸酵母最先是由伯約尼克1889年發(fā)現(xiàn)的隨著1950年發(fā)現(xiàn)了乳糖不耐癥的病因，1960年研制出乳糖酶，才得以應用乳糖酶日攝入量不受限制，已由FDA和JACFA等權威評審機構確認為安全物質乳糖酶的調控7上述所述乳糖酶產(chǎn)品最適溫度均在37℃左右，對于生產(chǎn)低乳糖制品的儲存和運輸并不利，低溫乳糖酶具有中溫乳糖酶無法達到的優(yōu)越性，多數(shù)學者開始從低溫壞境中分離乳糖酶產(chǎn)生菌，通過16SrRNA序列分析可知，多數(shù)低溫乳糖酶產(chǎn)生菌屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)和交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)，隨著研究的深入，低溫乳糖酶的生產(chǎn)成本也將大幅降低同時將乳糖酶固定化后生產(chǎn)低乳糖制品也受到了多數(shù)酶學專家的關注，既能提高生產(chǎn)效率，也能明顯降低生產(chǎn)成本重點！重點！1234乳糖酶作為一種食品添加劑,在乳品工業(yè)中應用廣泛但乳糖酶的實際應用企業(yè)數(shù)量少,在實際應用中的復雜條件限制了乳糖酶的應用范圍,如乳糖酶由于胃液的酸性和蛋白酶的作用而喪失活性,工業(yè)應用中反應條件復雜導致乳糖酶的重復性使用次數(shù)少、穩(wěn)定性低等缺點可用于GOS的生產(chǎn)[5]、無乳糖/低乳糖牛奶的生產(chǎn)[6]、乳制品副產(chǎn)物乳清的降解[7?8]、低乳糖冰激凌的生產(chǎn)[9]等乳糖酶固定化技術的發(fā)展為克服以上難題提供了有效途徑重點！乳糖酶固定化技術的發(fā)展為克服以上難題提供了有效途徑固定化乳糖酶是將乳糖酶和載體相互結合在一起,控制反應在一定的空間范圍內,固定化乳糖酶有利于回收后的重復使用和提高乳糖酶穩(wěn)定性傳統(tǒng)乳糖酶固定化方法較高的生產(chǎn)成本和較低的乳糖酶固定化效率限制了乳糖酶固定化載體材料的商業(yè)應用隨著新材料和生物技術的發(fā)展,乳糖酶固定化效率有了一定程度的提高,越來越多應用于乳品工業(yè)、醫(yī)藥等領域乳糖酶的固定4乳糖酶的固定1傳統(tǒng)乳糖酶固定方法固定化酶技術是利用有機或無機固體材料把酶分子限定在一定區(qū)域內,同時不影響酶催化活性,使酶能夠連續(xù)重復使用的技術[10]?？捎行岣呙傅氖褂眯?、增加酶的穩(wěn)定性、控制催化反應的啟動和終止。乳糖酶可通過物理和化學方法固定,物理方法包括吸附法、包埋法,化學方法包括共價結合法、交聯(lián)法[11]乳糖酶的固定固定化酶技術是利用有機或無機固體材料把酶分子限定在一定區(qū)域內,同時不影響酶催化活性,使酶能夠連續(xù)重復使用的技術[10]?？捎行岣呙傅氖褂眯?、增加酶的穩(wěn)定性、控制催化反應的啟動和終止。乳糖酶可通過物理和化學方法固定,物理方法包括吸附法、包埋法,化學方法包括共價結合法、交聯(lián)法[11]吸附法是通過酶與載體間的相互作用,實現(xiàn)固定化過程,依據(jù)酶和載體作用方式,可分為物理吸附、靜電吸附、親和吸附和疏水吸附[12]。這種作用力不牢固,酶易脫落。乳糖酶一般溶解在緩沖溶液中,經(jīng)過足夠長的時間孵化,促進乳糖酶和載體的相互作用吸附法是將酶固定在載體上的最簡單的方法,這種方法的優(yōu)點是可以最大限度地保留酶活性且操作簡單。CARPIO等[13]將乳糖酶和淀粉轉葡糖苷酶吸附固定在骨粉上,所有的酶活性都被保留。將乳糖酶吸附在DuoliteA568樹脂上時,相互作用120min后,可以達到幾乎100%的酶活性[14]乳糖酶的固定1JOVANOVIC等[16]使用該法固定乳糖酶,用于乳清中GOS的合成。固定化乳糖酶經(jīng)過7次重復使用后保留95%活性。乳糖酶的微囊固定方法是包埋法的一種,乳糖酶通常包埋在生物聚合物微囊中[17]2共價結合固定法是在酶和載體之間通過共價鍵形成牢固的連接,從而最大限度地減少酶從載體中泄漏引起的活性損失[18]。共價結合是酶與載體結合最有效和最穩(wěn)定的方法之一,它可以防止蛋白質洗脫到溶液中3然而,共價方法可能相對昂貴且復雜,因為在大多數(shù)情況下,載體材料需要初步活化[19]。其次,共價反應激烈會導致酶活損失,可以通過保護蛋白質的三維結構延長其壽命[20]。乳糖酶的共價結合是通過將蛋白質的游離氨基和載體共價結合,使乳糖酶和載體之間形成牢固的連接[21]4交聯(lián)法是利用酶自身的雙功能團結構,加入交聯(lián)劑(如戊二醛、乙烯共聚物、馬來酰亞胺)連接起來的一種固定方法,可使酶和載體間鍵合,也可在無載體情況下,使酶分子間形成聚合物[22]。該法操作成本低,能防止酶泄露,交聯(lián)反應可能發(fā)生在酶的活性中心,從而使酶活降低或失活,降低固定化酶的回收率乳糖酶的固定交聯(lián)法通常與其他固定化方法結合以提高固定化效果。FREITAS等[23]通過將乳糖酶在海藻酸鈉和明膠中包埋并與戊二醛交聯(lián)來提升固定化乳糖酶的穩(wěn)定性。固定化乳糖酶使用25次后,酶活性降低了20%在實際應用時,為了提高固定化乳糖酶的使用效率,有時將兩種或兩種以上的固定化方法并用,如吸附-交聯(lián)、包埋-交聯(lián)、吸附-包埋-交聯(lián)。通過吸附法可以提高乳糖酶的固定化率,在通過包埋-交聯(lián)相結合的方法增加結合強度,解決乳糖酶泄露和固定化乳糖酶操作穩(wěn)定性問題乳糖酶的固定2新興乳糖酶固定方法2.1交聯(lián)酶聚集體技術交聯(lián)酶聚集體(cross-linkedenzymeaggregates,CLEAs)技術被認為是一種有效的無載體固定化方法[24]。通常向酶的水溶液中加入蛋白沉淀劑(如硫酸銨),使酶沉淀析出形成非共價鍵連接的聚集體,加入交聯(lián)劑與酶產(chǎn)生交聯(lián),離心收集沉淀后,用緩沖溶液洗滌[25]乳糖酶的固定交聯(lián)酶聚集體(cross-linkedenzymeaggregates,CLEAs)技術被認為是一種有效的無載體固定化方法[24]。通常向酶的水溶液中加入蛋白沉淀劑(如硫酸銨),使酶沉淀析出形成非共價鍵連接的聚集體,加入交聯(lián)劑與酶產(chǎn)生交聯(lián),離心收集沉淀后,用緩沖溶液洗滌[25]CLEAs操作簡單且可使用粗酶提取物和共同固定化多種不同酶(如圖1),CLEAs可由兩種或兩種以上的酶共同固定化以獲得更強的催化能力[26]。所得的CLEAs能有效提高酶在應用中的穩(wěn)定性和回收率。盡管該技術已應用于各種酶,但交聯(lián)效率不高、大分子底物的傳質阻力等限制了其進一步的應用[27]乳糖酶的固定乳糖酶的固定2.2透性化細胞大多數(shù)乳糖酶以胞內酶形式存在,透性化細胞不需要對乳糖酶進行純化,同時避免乳糖酶在固定化中的活性損失。透性化細胞主要通過改變細胞膜和細胞壁的通透性,使得小分子可以自由出入細胞,通常用乙醇處理含有胞內酶的細胞,使得葡萄糖、乳糖、半乳糖和GOS等底物與產(chǎn)物能自由進出細胞乳糖酶的固定GOBINATH等[30]以植物乳桿菌來源的乳糖酶生產(chǎn)GOS,探究了乙醇、正丁醇透性化處理對活性的影響,優(yōu)化透性化處理過程后,乳糖酶活性提升近2倍乳糖酶的固定2.3定向技術定向技術能避免酶分子與載體無序性連接,通過蛋白融合標簽等方法實現(xiàn)酶蛋白與載體特定位點的定向結合,避免活性位點在隨機連接中被破壞,通過蛋白融合實現(xiàn)定向共價固定化,同時將目標酶與標簽蛋白共同表達乳糖酶的固定定向技術能避免酶分子與載體無序性連接,通過蛋白融合標簽等方法實現(xiàn)酶蛋白與載體特定位點的定向結合,避免活性位點在隨機連接中被破壞,通過蛋白融合實現(xiàn)定向共價固定化,同時將目標酶與標簽蛋白共同表達MERLO等[33]使用了一種具有固定和自識別功能的蛋白標簽(anchoringandself-labellingproteintag,AGT)用于在大腸桿菌外膜上標記和表面固定酶,將β-糖苷酶固定在大腸桿菌表面,在不影響酶催化活性的情況下,構建了具有催化功能的融合蛋白,一步完成了酶的表達和自固定化,為乳糖酶的自固定化提供了參考乳糖酶的固定ANDRAD