蛋白質(zhì)分離純化及鑒定

生物化學(xué)重慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校佘玉罕蛋白質(zhì)分離純化及鑒定

一、蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟1.蛋白質(zhì)樣品的前處理2.蛋白質(zhì)粗提液的粗分級(jí)分離3.濃縮蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)分離4.蛋白質(zhì)的結(jié)晶二、蛋白質(zhì)的分離純化方法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的性質(zhì)不同對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。分子大小溶解度電荷吸附性質(zhì)對(duì)配體分子的生物學(xué)親和力（一）透析和超濾透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法。超濾法應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)。原理：透析流程透析裝置透析樣品透析袋上部空間透析液透析袋攪拌子磁力攪拌器換過(guò)幾次透析液后透析液蛋白分子小分子半透明透析袋透析袋內(nèi)透析袋外超過(guò)濾裝置使用壓力或者離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜（半透膜），達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。

裝好具備密度梯度的介質(zhì)溶液

離心

收集分離后的各組分

加入：混和蛋白質(zhì)樣品離心裝置（二）密度梯度（區(qū)帶）離心（三）鹽溶和鹽析鹽溶(salting-in)：低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的鹽溶現(xiàn)象。同濃度二價(jià)中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響比單價(jià)中性鹽大的多。鹽析(salting-out)：當(dāng)溶液中的離子強(qiáng)度達(dá)到一定的數(shù)值時(shí)(鹽濃度高達(dá)一定數(shù)值)，蛋白質(zhì)的溶解度開(kāi)始下降，很多蛋白質(zhì)從水溶液中析出，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。（四）有機(jī)溶劑分級(jí)分離法與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低，在室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。這種沉淀的主要原因是有機(jī)溶劑的加入改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。（五）電泳由于蛋白質(zhì)在指定的pH溶液中所帶電荷和分子量不同，形狀不同，在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度不同。因此根據(jù)這一原理就可以從蛋白質(zhì)混合液中將各種蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，所以電泳技術(shù)已成為分析、分離蛋白質(zhì)的重要手段之一。電泳：1、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE電泳)它以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板(不連續(xù)體系)。凝膠的濃度(孔徑大小)、緩沖液組分和離子強(qiáng)度、pH以及電場(chǎng)強(qiáng)度都不同濃縮膠分離膠樣品濃縮成很薄的起始區(qū)帶(0.1mm)分離成單區(qū)帶2、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS:是用SDS(十二烷基硫酸鈉)和還原劑(通常為巰基乙醇)先對(duì)待分離的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)處理(加熱煮沸3－5分鐘)。通過(guò)加熱和SDS可以使蛋白質(zhì)變性：多亞基的蛋白質(zhì)解離為單亞基，二硫鍵被切斷。SDS是帶有負(fù)電荷的分子，所有結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)的形狀近似于長(zhǎng)的橢圓棒，全部帶上了大量的負(fù)電荷。電泳時(shí)SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響(全部由負(fù)極向正極移動(dòng))，而主要取決于蛋白質(zhì)分子量。(SDS)濃縮膠分離膠樣品SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置點(diǎn)樣濃縮膠分離膠樣品SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置3、毛細(xì)管電泳①泛指高效毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、自由溶液毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電泳。②用途：分離多種生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、DNA片段（例如合成的寡核苷酸）和核酸以及多種小分子，如藥物、甚至金屬離子。用樣量5～30μl1mg/ml溶液。4、等電聚焦電泳等電聚焦或稱(chēng)電聚焦，是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，它也可用于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定。蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)(如濃蔗糖溶液)中進(jìn)行電泳的。在外電場(chǎng)作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH梯度處，并形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。等電聚焦可以把人的血清分成40多個(gè)條帶。此技術(shù)特別適用于同功酶的鑒定。只要它們的pI有0.02(甚至<0.02)pH單位的差別就能分開(kāi)。實(shí)際上是利用緩沖液在電場(chǎng)作用下在凝膠內(nèi)沿電場(chǎng)方向制造一個(gè)pH梯度。所用的緩沖液是低分子量的有機(jī)酸和堿的混合物，該混合物稱(chēng)之兩性電解質(zhì)。等電聚焦電泳裝置當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品在這樣的凝膠上電泳時(shí)，每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI

相一致的pH處，具有不同pI的各種蛋白質(zhì)最后都遷移至凝膠中相應(yīng)的pH處，達(dá)到分離的目的。膠中摻入兩性電解質(zhì)溶液預(yù)電泳加樣電泳pH9電場(chǎng)作用下膠中建立了穩(wěn)定的pH梯度3加入蛋白樣品染色后蛋白按pH梯度分布5、蛋白質(zhì)的雙向電泳將等電聚焦電泳與SDS結(jié)合起來(lái)的電泳技術(shù)。電泳方向電泳方向等電聚焦電泳SDS第一向等電聚焦（IFE)第二向SDSpI降低第一向電泳后膠橫向放在第二向膠上第二向膠pI降低雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向反映出蛋白在pI上的差異，而垂直方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e。所以雙向電泳可以將分子量相同而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)以及等電點(diǎn)相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。雙向電泳結(jié)果（凝膠經(jīng)CBB染色）pI降低分子量減小填充到層析柱中的樹(shù)脂有陽(yáng)離子交換型和陰離子交換型。支持介質(zhì)：

對(duì)蛋白質(zhì)交換容量大陽(yáng)離子交換劑陰離子交換劑CM—纖維素(弱酸型)P纖維素(中強(qiáng)酸型)SE纖維素(強(qiáng)酸型)SPSephadex(強(qiáng)酸型)AM—纖維素(弱堿型)PAB--纖維素(弱堿型)DEAE-纖維素(中強(qiáng)堿型)DEAE-Sephadex(中強(qiáng)堿型)TEAE-纖維素(強(qiáng)堿型)QAESephadex(強(qiáng)堿型)（六）離子交換層析以陽(yáng)離子交換型樹(shù)脂為例將帶有耐酸性非常強(qiáng)的磺酸根SO3-Na＋（以鹽的形式出現(xiàn)）的強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（固定相）填充到層析柱中。將含有樣品的流動(dòng)相加入層析柱中，樣品中帶有正電荷的蛋白質(zhì)X，通過(guò)靜電吸引，與樹(shù)脂中的帶電基團(tuán)相互作用，結(jié)果X與Na＋交換（陽(yáng)離子交換），形成SO3-X，蛋白質(zhì)就結(jié)合到了層析柱上。在樣品與樹(shù)脂充分交換后，可通過(guò)提高流動(dòng)相中的鹽濃度，或改變流動(dòng)相的pH，或是同時(shí)采用這兩種方法，就可以將結(jié)合于樹(shù)脂上的蛋白質(zhì)