霍亂實驗室檢測技術培訓課件

霍亂實驗室檢測技術霍亂的流行情況霍亂的生物學性狀樣本的采集檢驗操作程序熒光定量PCR方法檢測O1群、O139群霍亂弧菌及霍亂毒素提綱2霍亂實驗室檢測技術由O1群、O139群霍亂弧菌引起的霍亂以發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣、能引起大流行為特征，被世界衛(wèi)生組織列為國境衛(wèi)生檢疫傳染病，也是我國傳染病防治法中規(guī)定強制管理的甲類傳染病。3霍亂實驗室檢測技術O1群霍亂弧菌的流行情況1817年~1923年發(fā)生六次霍亂的世界大流行均由O1群霍亂弧菌古典生物型引起1820年古典生物型引起的霍亂首次傳到我國1961年開始了第七次霍亂的世界大流行均由O1群霍亂弧菌埃爾托生物型引起（1905年發(fā)現(xiàn)）1961年埃爾托生物型霍亂首次傳到我國4霍亂實驗室檢測技術O139群霍亂弧菌的流行情況1992年印度馬德拉斯發(fā)生O139霍亂并迅速傳播1993年6月我國新疆發(fā)現(xiàn)O139霍亂流行。1994年我市發(fā)現(xiàn)O139霍亂疫情O1群和O139群霍亂弧菌與其他霍亂弧菌的最大區(qū)別是能產(chǎn)生相同的霍亂毒素5霍亂實驗室檢測技術弧菌的分類形態(tài)與染色抗原結構、血清群生長與培養(yǎng)特性生化反應特性對外界的抵抗力藥物敏感性霍亂的生物學性狀6霍亂實驗室檢測技術弧菌的分類（包括5個屬）弧菌屬霍亂弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌等等氣單胞菌屬鄰單胞菌屬發(fā)光菌屬水棲菌屬霍亂的生物學性狀7霍亂實驗室檢測技術形態(tài)與染色革蘭氏染色陰性，兩端鈍圓或稍平單鞭毛、魚群樣排列，菌體彎曲呈弧形或逗點狀暗視野顯微鏡下，霍亂弧菌運動活潑，呈穿梭狀或流星狀培養(yǎng)基上菌落略帶灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑濕潤霍亂的生物學性狀8霍亂實驗室檢測技術革蘭氏染色陰性，兩端鈍圓或稍平9霍亂實驗室檢測技術單鞭毛、魚群樣排列，菌體彎曲成弧形或逗點狀10霍亂實驗室檢測技術11霍亂實驗室檢測技術抗原結構、血清群H抗原和O抗原根據(jù)O抗原不同，分為200多個血清型根據(jù)O抗原成分的不同分群特異性抗原因子和型特異性抗原因子O1群據(jù)型特異性抗原成分不同分為小川、稻葉、彥島三個血清型小川型含A、B抗原因子，也含少量C因子成分稻葉型含A、C因子彥島型含A、B、C因子霍亂的生物學性狀12霍亂實驗室檢測技術

生長與培養(yǎng)特性好氧同時兼性厭氧，最適生長溫度37℃鈉離子可刺激生長耐堿不耐酸初次分離時常用堿性蛋白胨水(pH8.8-9.0)增菌培養(yǎng)，霍亂弧菌經(jīng)6～8h增菌后可在液體表面大量繁殖，形成菌膜霍亂的生物學性狀13霍亂實驗室檢測技術14霍亂實驗室檢測技術

生化反應特性兩個生物型的霍亂弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣遲緩發(fā)酵乳糖，不分解阿拉伯糖氧化酶試驗弧菌屬細菌大多為陽性粘絲實驗弧菌屬細菌大多為陽性霍亂的生物學性狀15霍亂實驗室檢測技術

對外界的抵抗力在河、井、海水中可存活13周以上食物和海產(chǎn)品上存活7天左右對低溫和堿耐受力強（在食品上的弧菌于冰箱保存（0~5度）比室溫存活時間長）對熱、干燥、太陽直射敏感對含氯制劑、碘制劑敏感對酸和強氧化劑極敏感煮沸100度1~2min即可被殺死藥物敏感性細菌帶有可傳遞的耐藥質粒近年產(chǎn)生多重耐藥株（丁胺卡那霉素、強力霉素、復方新諾明）諾氟沙星和環(huán)丙沙星對霍亂弧菌保持較高的敏感性

霍亂的生物學性狀16霍亂實驗室檢測技術霍亂的致病性主要毒素霍亂腸毒素CT小帶聯(lián)結毒素zot輔助霍亂腸毒素ace溶血素、溶細胞素、志賀樣毒素O139群除具有上述O1群的致病物質外，還存在莢膜多糖和特殊LPS毒性決定簇，可抵抗血清中殺菌物質和黏附到小腸黏膜上。

霍亂的生物學性狀17霍亂實驗室檢測技術

腹瀉患者樣本采集水樣便采1~3ml，成形便取指甲大小量肛拭子：生理鹽水浸濕采便管由肛門插入直腸內3~5cm處旋轉取出嘔吐物采1~3ml標本和堿胨水比例為1：5水樣及液體標本采集采集相對靜止表層水（30cm內）500ml其他液體標本采集500ml2~3小時內送檢涂抹樣本采集2~3支無菌棉簽涂抹3~5只以上水生動物表面、腮部及泄殖腔2~3支無菌棉簽涂抹食品或物品表面（地溝口，下水管口，水池壁涂抹，餐盤內外側）直接放入10ml堿胨水送檢樣本的采集18霍亂實驗室檢測技術典型的米泔水樣便19霍亂實驗室檢測技術

動力試驗水樣便：取一滴在玻片上，蓋蓋玻片，暗視野顯微鏡直接觀察成形便：取適量在生理鹽水中研磨，蓋蓋玻片，鏡下觀察高度可疑樣本：取增菌的堿胨水在玻片上，蓋蓋玻片，鏡下觀察鏡下有穿梭樣運動為動力試驗陽性動力抑制試驗取O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清，取適量標本在其中研磨穿梭樣運動消失，菌體凝集成塊為動力抑制試驗陽性檢驗操作程序20霍亂實驗室檢測技術

增菌及分離培養(yǎng)堿性蛋白胨水pH8.8-9.0注意標本和胨水的比例要適當分離培養(yǎng)基分兩類選擇性強的培養(yǎng)基四號瓊脂、TCBS、慶大培養(yǎng)基選擇性弱的培養(yǎng)基堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂檢驗操作程序21霍亂實驗室檢測技術霍亂弧菌在慶大培養(yǎng)基上菌落形態(tài)。(菌落呈現(xiàn)無色、圓形半透明、濕潤、扁平或稍突起、邊緣整齊，由于亞碲酸鉀的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色）22霍亂實驗室檢測技術病人糞便標本增菌３７℃6-8h慶大平皿劃線培養(yǎng)３７℃18-24h每皿挑取9-10個可疑菌落血清凝集試驗向醫(yī)院屬地CDC報告醫(yī)學觀察病例霍亂分群診斷（單克隆抗體）Ｏ１群Ｏ１３９群

二次增菌３７℃6-8h1、懸滴動力試驗（+），動力抑制試驗（+）2、有明確流行病學史，動力試驗（+），動力抑制試驗（+）癥狀典型但服藥患者便檢驗操作程序24霍亂實驗室檢測技術

菌株的初步鑒定血清凝集試驗復核及鑒定血清凝集試驗革蘭氏染色氧化酶試驗粘絲試驗動力試驗檢驗操作程序25霍亂實驗室檢測技術

菌株的初步鑒定血清凝集試驗挑取可疑菌落與O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗，很快出現(xiàn)均勻沙粒樣凝集顆粒為陽性（一般不超過10s）注意：菌液渾濁，似凝非凝不能判定為陽性同時做生理鹽水對照在1min內不出現(xiàn)凝集為陰性結果可疑時需要做PCR鑒定檢驗操作程序26霍亂實驗室檢測技術

菌株的復核及分型血清凝集試驗用O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清與挑取的菌落進行玻片凝集O1群霍亂弧菌分型用小川型和稻葉型單價血清進行玻片凝集結果分3種情況同時做生理鹽水對照檢驗操作程序27霍亂實驗室檢測技術

菌株的復核及分型氧化酶試驗弧菌屬大部分為陽性，作為弧菌的簡易輔助鑒定方法用氧化酶試劑（1%鹽酸二甲基對苯二胺）濕潤濾紙取營養(yǎng)瓊脂上菌落涂抹于有試劑的濾紙上反應部位在1~2min內出現(xiàn)粉紅-紫紅-紫藍色判為陽性腸桿菌科細菌不變色或變粉后很快退色注意不使用過期試劑和金屬接種針檢驗操作程序28霍亂實驗室檢測技術

菌株的復核及分型粘絲試驗弧菌屬大部分為陽性作為弧菌的簡易輔助鑒定方法在玻璃平皿上滴一大滴0.5%去氧膽酸鈉溶液取營養(yǎng)瓊脂上新鮮培養(yǎng)物研磨后與試劑研磨混合混懸液變清亮粘稠，可拉出細長絲者為陽性陰性者呈均勻懸液狀態(tài)動力試驗革蘭氏染色檢驗操作程序29霍亂實驗室檢測技術

藥敏試驗根據(jù)美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）推薦的Kirby-Bauer（K-B）氏法進行。檢驗操作程序菌種接種營養(yǎng)瓊脂37℃16～18h

菌落接種營養(yǎng)肉湯37℃4～6h

調整菌液到0.5麥氏單位MH培養(yǎng)基上涂布菌液貼藥敏紙片游標卡尺測量抑菌圈直徑

37℃18～24h

30霍亂實驗室檢測技術

藥敏試驗注意事項每次藥敏試驗必須用ATCC25922大腸桿菌做質控使用的MH培養(yǎng)基不能太薄使用的MH培養(yǎng)基PH值應為7.3抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限

不可用過期的試劑和藥敏紙片檢驗操作程序31霍亂實驗室檢測技術

熒光定量PCR方法鑒定探針和引物檢驗操作程序SO1FGACTCACCTTCGATTTCAGCAASO1RGAATAACTCAAGGCGATGAAGTGATO1probeFACGGGTAACGCACCACACTGGACTATGPSO139FGCGGTGTAGCGGGTTTTATTAGSO139RTGCATAATACTTTCGACCATGGAO139probeFAAACAGTCGACCGGCGATAAACGCTPSCTXFTTTCATCGCAAGTATTACTCATCGASCTXRAAGAGCCGTGGATTCATCATGCTprobeFAGCATTCCCACAACCCGGCGP32霍亂實驗室檢測技術

熒光定量PCR方法鑒定模板的制備：挑取數(shù)個菌落加入裝有100μＬ去離子水的1.5mL管中,混勻后100℃10分鐘，12000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液作為模板。檢驗操作程序33霍亂實驗室檢測技術

熒光定量PCR方法鑒定反應體系的配制(20μＬ體系)

（PemixExTaqTM

TaKaRa

生物公司提供）

2×PCR反應混合物：10μＬ/份上游引物（10μM）：0.4μＬ/份下游引物（10μM）：0.4μＬ/份

探針（10μmol/Ｌ）：0.4μＬ/份

模板DNA：2μＬ/份

DDw：6.8μＬ/份