禽胚培養(yǎng)檢查法

禽胚培養(yǎng)檢查法病毒培養(yǎng)可用動(dòng)物接種、禽胚培養(yǎng)和組織培養(yǎng)法。許多感染人和動(dòng)物的病毒，特別是禽類的病毒都能在禽胚上生長(zhǎng)繁殖，因此禽胚培養(yǎng)是常用的病毒分離培養(yǎng)方法之一。用于這些病毒的分離、鑒定、制備抗原、疫苗生產(chǎn)以及研究病毒性質(zhì)等方面。來自禽類的病毒，均可在雞胚中繁殖，哺乳動(dòng)物的病毒如藍(lán)舌病病毒、流感病毒等也可在雞胚中增殖。目前雞胚尤其是SPF雞胚被廣泛利用于分離病毒、制造疫苗和抗原等，其來源豐富，操作簡(jiǎn)便。除病毒外，衣體、立克次氏體也可用雞胚來培養(yǎng)，衣原體可在雞胚卵黃囊繁殖，致死雞胚；部分立克次氏體也可在卵黃囊中繁殖。下面我們來學(xué)習(xí)一下病毒的雞胚接種技術(shù)。一、實(shí)驗(yàn)材料白殼雞胚、孵化箱、1mL注射器、蛋架、新城疫I系和Ⅱ系弱毒苗等。二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.雞胚的選擇和孵化應(yīng)選健康無病雞群的新鮮受精蛋。為便于照蛋觀察，以來航雞蛋或其他白殼蛋為好。用孵卵箱孵化，要特別注意溫度、濕度和翻蛋。孵化條件一般選擇相對(duì)濕度為60%，最低溫度36℃，一般37.5℃。每日翻蛋最少3次，開始可以將雞胚橫放，在接種前2d立放，大頭向上，注意雞胚位置，如胚胎偏在一邊易死亡。孵化3～4d，可用照蛋器在暗室觀察。雞胚發(fā)育正常時(shí)，可見清晰的血管及活的雞胚，血管及其主要分枝均明顯，呈鮮紅色，雞胚可以活動(dòng)。未受精和死胚胚體固定在一端不動(dòng)，看不到血管或血管消散，應(yīng)剔除。雞胚的日齡根據(jù)接種途徑和接種材料而定，卵黃囊接種，用6—8日齡的雞胚；絨毛尿囊腔接種，用9～10日齡雞胚；絨毛尿囊膜接種，用9～13日齡的雞胚；血管注射，用12～13日齡雞胚；羊膜腔和腦內(nèi)注射，用10日齡雞胚。2.接種前的準(zhǔn)備病毒接種材料的處理懷疑污染細(xì)菌的液體材料，加抗生素（青霉素100—500國(guó)際單位和鏈霉素100—500微克）置室溫中1h或冰箱12—24h高速離心取上清液，或經(jīng)濾器濾過除菌。如為患病動(dòng)物組織，應(yīng)剪碎、研磨、離心取上清液，必要時(shí)加抗生素處理或?yàn)V過。照蛋以鉛筆劃出氣室、胚胎的位置，若要作卵黃囊接種或血管注射，還要?jiǎng)澇鱿鄳?yīng)的部位。打孔用碘酊在接種處的蛋殼上消毒，并在該處打孔。三、雞胚的接種方法雞胚接種一般用結(jié)核菌素注射器注射，注射完后均應(yīng)用熔化的石蠟將接種孔封閉。1.絨毛尿囊腔內(nèi)注射取9—10日齡雞胚，用錐子在酒精燈火焰燒灼消毒后，在氣室頂端和氣室下沿?zé)o血管處各鉆一小孔，針頭從氣室下沿小孔處插入，深1.5cm，即已穿過了外殼膜且距胚胎有半指距離，注射量約0.1—0.2mL。注射后以石蠟封閉小孔，置孵育箱中直立孵育。2.卵黃囊內(nèi)注射取6—8日齡雞胚，可從氣室頂側(cè)接種（針頭插入3—3.5cm），因胚胎及卵黃囊位置已定，也可從側(cè)面鉆孔，將針頭插入卵黃囊接種。側(cè)面接種不易傷及雞胚但針頭拔出后部分接種液有時(shí)會(huì)外溢，需用酒精棉球擦去。其余同尿囊腔內(nèi)注射。3.絨毛尿囊膜接種人工氣室法取10—11日齡雞胚，先在照蛋燈下檢查雞胚發(fā)育狀況，劃出氣室位置，并選擇絨尿膜發(fā)育區(qū)作一“記號(hào)”。將胚蛋橫臥于蛋座上，絨尿膜發(fā)育區(qū)“記號(hào)”朝上。用碘酒消毒記號(hào)處及氣室中心部，在氣室中心部錐小孔。然后用錐子輕錐記號(hào)處蛋殼，約0.5mm深，使其卵殼穿孔而殼膜不破。用洗耳球吸去氣室部空氣的同時(shí)，隨即因上面小孔進(jìn)入空氣而絨尿膜陷下形成一個(gè)人工氣室，天然氣室消失。接種時(shí)針頭與卵殼成直角。自上面小孔直刺破卵膜進(jìn)入人工氣室約3—5mm，注人0.1～0.2mL病料，正好在絨尿膜上。接種完畢用熔化石蠟封閉兩孔，人工氣室向上，橫臥于孵化箱中，逐日觀察。直接接種法將雞胚直立于蛋座上，氣室向上氣室區(qū)中央消毒打孔，用針頭刺破殼膜，接種時(shí)針頭先刺入卵殼約0.5cm，將病料滴在氣室內(nèi)的殼膜上（0.1—0.2mL），再繼續(xù)刺入約1.0—1.5cm，拔出針頭使病料液即慢慢滲透到氣室下面的絨尿膜上，然后用石蠟封孔，放入孵化箱培養(yǎng)。本方法的原理為：殼膜脆，刺破后不能再閉合，而絨尿膜有彈性，當(dāng)針頭拔出后被刺破的小孔立即又閉合。4.羊膜腔內(nèi)接種所用雞胚為10日齡，有兩種方法。開窗法從氣室處去蛋殼開窗，從窗口用小鑷子剝開蛋膜，一手用平頭鑷子夾住羊膜腔并向上提另一手注射0.05～0.1mL病料液入腔內(nèi)，然后封閉人工窗，使蛋直立孵化，此法可靠，但胚胎易受傷而死，而且易污染。盲刺法將雞胚放在燈光向上照射的蛋座上，將蛋轉(zhuǎn)動(dòng)使胚胎面向術(shù)者。在氣室頂部到邊緣的半處打一孔，用40mm長(zhǎng)的針頭垂直插入，約深30mm以上。如已刺入羊膜腔，能使針頭撥動(dòng)胚即可注入病料液0.1—0.2mL，如針頭左右移動(dòng)時(shí)胚胎隨著移動(dòng)，則針頭已刺入胚胎，這時(shí)應(yīng)將針頭稍稍提起后再注射。拔出針頭后石蠟封閉小孔。置孵化箱中培養(yǎng)。四、接種后檢查接種后24h內(nèi)死亡的雞胚，系由于接種時(shí)雞胚受損或其他原因而死亡，應(yīng)該棄去，24h后，每天照蛋2次，如發(fā)現(xiàn)雞胚死亡立即放入冰箱，于一定時(shí)間內(nèi)不能致死的雞胚亦放入冰箱凍死。死亡的雞胚置冰箱中1—2h即可取出收取材料并檢查雞胚病變。五、雞胚材料的收獲收獲前應(yīng)將雞胚于4℃放置6h或過夜，使血液凝固以免收獲時(shí)流出的紅細(xì)胞與尿囊液或羊水中的病毒發(fā)生凝集，影響試驗(yàn)結(jié)果。1.絨毛尿囊膜接種用碘酊消毒人工氣室上卵殼，將滅菌小剪刀插入氣室內(nèi)，沿人工氣室的界線剪去殼膜，露出絨毛尿囊膜，用無菌鑷子輕輕夾起絨毛尿囊膜，用無菌剪刀沿人工氣室周圍將接種的絨毛尿囊膜全部剪下，置于滅菌的平皿內(nèi)，觀察病變。病變明顯的膜，可放入50%甘油保存。2.尿囊腔接種用碘酊和乙醇消毒氣室部位蛋殼，用鑷子去除蛋殼和殼膜，撕破絨毛尿囊膜而不破壞羊膜。再用無菌鑷子輕輕按住雞胚，用滅菌吸管吸取尿囊液，裝入滅菌容器內(nèi)，多時(shí)可收集到5—8mL/枚雞胚。收集的液體應(yīng)清亮，混濁則往往表示有細(xì)菌污染，需做無菌檢驗(yàn)。如有少量血液混入，可以1500/min的速度離心10min，重新收獲上清液。3.卵黃囊接種在收集完絨毛尿囊液和羊水后，用吸管收集卵黃液。所有收集到的材料通過無菌檢查后均在—70℃貯存?zhèn)溆谩?.羊膜腔接種先按照上述方法收集完絨毛尿囊液后，再用注射器插入羊膜腔內(nèi)收集羊水，一般可獲得1mL/枚雞胚左右。六、消毒將用過的鑷子、剪刀等放入煮沸鍋內(nèi)消毒5min，取出后擦干包好，高壓滅菌待用。卵殼、雞胚等置于消毒液中浸泡過夜，然后棄掉。無菌室內(nèi)用紫外線燈消毒30min。七、注意事項(xiàng)（1）雞胚污染即可引起發(fā)育雞胚死亡或影響病毒的培養(yǎng)，故整個(gè)操作應(yīng)在無菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)完成，做到無菌