T-SHRH 024-2019 化妝品眼刺激性試驗(yàn) 體外重組3D角膜模型半數(shù)有效時(shí)間測(cè)試方法（ET50）

71.100.70C2682Y42

T/SHRH

024-2019________________________________________________________________________________________

ETEye

irritation

cosmetics-In

vitro

ET50

T/SHRH

024-2019前言…………… 21

32.

規(guī)范性引用文件………… 33.

術(shù)語(yǔ)、定義……………… 34.

試劑及儀器設(shè)備………… 35.

試驗(yàn)步驟………………… 46.

結(jié)果計(jì)算………………… 57.

質(zhì)量控制………………… 5附錄

A

6附錄

B

7T/SHRH

024-2019 本標(biāo)準(zhǔn)按照

GB/T1.1-2009

給出規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)提出和歸口。本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利，本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。公司、上海創(chuàng)元化妝品有限公司、福建片仔癀化妝品有限公司、東阿阿膠股份有限公司、上海綠瑞生物科技有限公司、云南貝泰妮生物科技集團(tuán)股份有限公司、上海清軒生物科技有限公司、上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司、上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)。明、謝阿貴、廖峰、姜春鵬、趙奕竹、馬驍、王飛飛、高宏旗、朱翠翠、李瓊、金堅(jiān)、陳亦華。T/SHRH

024-2019化妝品眼刺激性試驗(yàn)

體外重組

角膜模型半數(shù)有效時(shí)間測(cè)試方法（ET1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了一種基于體外重組

角膜模型的眼刺激性測(cè)試方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于化妝品原料和成品的眼刺激性測(cè)試。本標(biāo)準(zhǔn)可作為眼刺激性動(dòng)物試驗(yàn)的替代方法之一，可結(jié)合其他方法對(duì)眼刺激性進(jìn)行綜合分析。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T

化學(xué)品

體外皮膚腐蝕

人體皮膚模型試驗(yàn)方法化妝品安全技術(shù)規(guī)范3 術(shù)語(yǔ)、定義3.1

眼刺激性

眼前部直接接觸待測(cè)物后，引起的眼及周圍粘膜組織可逆性炎性損傷。3.2

viability測(cè)定細(xì)胞群體總活力的指標(biāo)

[如細(xì)胞線粒體脫氫酶還原活性染料噻唑藍(lán)（3-（4，5-二甲基噻唑），5-二苯基四氮唑溴鹽，MTT]總數(shù)和活性細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。3.3

，ET待測(cè)物在固定濃度下導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低

50％所需的暴露時(shí)間。3.4

吸光度

optical

OD種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成正比關(guān)系。4 試劑及儀器設(shè)備4.1

試劑和材料4.1.1

體外重組

角膜模型（BioOcullar?）。4.1.2

體外重組

角膜模型培養(yǎng)液（BioRecovery

培養(yǎng)液）。4.1.3

磷酸鹽緩沖液

（PBS）。4.1.4

X-100

(0.3%，V/V)。4.1.5

（CAS

）。4.1.6

異丙醇。4.2

儀器和設(shè)備4.2.1

移液器：

活塞排代式移液器及相應(yīng)吸頭，20μL~200μL、100μL~1000μL

移液器及相應(yīng)吸頭。T/SHRH

024-20194.2.2

培養(yǎng)箱：37℃±1℃，（5±1），95%相對(duì)濕度。4.2.3 酶標(biāo)儀：570nm。4.2.4 超凈工作臺(tái)。4.2.5 水平振蕩儀。4.2.6 分析天平（精度

）。5 試驗(yàn)步驟5.1

準(zhǔn)備工作5.1.1

待測(cè)樣品與

MTT

用

PBS

緩沖液配置

的

MTT

母液，將

母液用

PBS

稀釋至

的

MTT

工作液。取一個(gè)

24

24

24

孔中設(shè)置

2mL

的

MTT

80μL

或

待測(cè)樣品加入

MTT

CO

培養(yǎng)箱（37±1℃、、95%相對(duì)濕度）中，孵育

3h。觀察與對(duì)照孔是否有顏色差異，若MTT

溶液出現(xiàn)變藍(lán)或紫色，說(shuō)明待測(cè)樣品與

反應(yīng)，后續(xù)測(cè)試中需使用致死模型去掉非特異性吸光度值。若無(wú)顏色反應(yīng)，則無(wú)需制備致死模型。5.1.2

制備致死模型將體外重組

24

孔板中，每孔加入

2mL

無(wú)菌去離子水，置于

4℃靜置

24h

后，將角膜模型轉(zhuǎn)移至℃冰箱保存，不超過(guò)

6

個(gè)月。5.1.3

模型準(zhǔn)備體外重組

根據(jù)模型數(shù)量，按照

3

個(gè)模型

孔板，準(zhǔn)備

6

孔板，并在每個(gè)孔中加入

BioRecovery

培養(yǎng)液。將體外重組

6

CO、孵育

。培養(yǎng)結(jié)束后，用無(wú)菌鑷子將模型從

6

6

孔板放回至CO培養(yǎng)箱（37±1℃、

、相對(duì)濕度）中，孵育過(guò)夜（5.1.4

待測(cè)物預(yù)處理

37±1℃條件下預(yù)處理

用移液器可以吸取，則視為液體；若不能則視為固體。粉末狀、顆粒狀等待測(cè)物以固體對(duì)待。固體受試物需研磨至粉末方可進(jìn)行給藥。5.2

固體待測(cè)物用分析天平稱取

，給藥漏斗輕置于模型表面，使待測(cè)物均勻鋪展。液體待測(cè)物吸取

80μL液給藥。5.3

后孵育陽(yáng)性對(duì)照（0.3%）給藥后孵育時(shí)間設(shè)置為

，，，；洗去型化妝品待測(cè)物的給藥后孵育時(shí)間設(shè)置為

，，，；駐留型化妝品待測(cè)物的給藥后孵育時(shí)間設(shè)置為：0h，6h，16h，24h；給藥后孵育時(shí)間也可根據(jù)待測(cè)物特性進(jìn)行微調(diào)。5.4

模型孵育培養(yǎng)結(jié)束后，開(kāi)始清洗程序。用無(wú)菌

PBS

溶液重復(fù)清洗模型表面

次，去除殘留的待T/SHRH

024-2019測(cè)物。每個(gè)模型的清洗總時(shí)間需控制在

。5.5

MTT

反應(yīng)根據(jù)模型總數(shù)量準(zhǔn)備

24

孔板，并向每孔加入

的

MTT

工作液。將模型轉(zhuǎn)移至

24

孔板中，置于

培養(yǎng)箱中（℃、

、95%相對(duì)濕度），孵育

。MTT

液器吸棄

溶液，加入

300μLPBS

溶液，清洗模型外表面，重復(fù)此清洗過(guò)程

3

次。5.6

異丙醇浸提將模型外表面用無(wú)菌棉簽擦干，轉(zhuǎn)移到新的

24

孔板中，在模型內(nèi)加入

2mL

異丙醇。用封口膜密封

24

孔板，于

4℃靜置過(guò)夜或在水平震蕩器上常溫震搖

。5.7

OD

值測(cè)定從每孔中吸取

2

份

200μL

96

白對(duì)照，酶標(biāo)儀

570nm

波長(zhǎng)讀取吸光度（OD）值。6 結(jié)果計(jì)算6.1

空白對(duì)照：讀取

3

個(gè)空白對(duì)照

OD

值，其平均值作為空白對(duì)照

OD

值。6.2

陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)組織活力=（陽(yáng)性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)

OD

值-空白對(duì)照

OD

/（陽(yáng)性對(duì)照組

OD

值-空白對(duì)照

OD

。6.3

待測(cè)樣品：待測(cè)物組各時(shí)間點(diǎn)組織活力=（待測(cè)物組各時(shí)間點(diǎn)

OD

值-空白對(duì)照

OD

值）/（陽(yáng)性對(duì)照組

OD

值-空白對(duì)照

OD

值）。6.4

值計(jì)算以各組組織活力鄰近

50%左右的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)組織活力為縱坐標(biāo)，繪制折線圖，計(jì)算線性回歸方程。根據(jù)公式，計(jì)算組織活力為

時(shí)，對(duì)應(yīng)的時(shí)間，即為該組的

7

質(zhì)量控制7.1

基本原則：測(cè)試中設(shè)置的對(duì)照檢測(cè)應(yīng)符合以下情況，如出現(xiàn)非下述標(biāo)準(zhǔn)，則視為質(zhì)控不合格。7.2

陽(yáng)性對(duì)照：ET值反映體外重組

角膜模型的屏障功能,其合格質(zhì)控范圍為

；

OD值反映體外重組

角膜模型的活性，其合格質(zhì)控范圍為

0.8~2.5。7.3

待測(cè)物：每個(gè)待測(cè)物同一暴露時(shí)間下

3

個(gè)重復(fù)模型的相對(duì)活性標(biāo)準(zhǔn)偏差小于或等于

。T/SHRH

024-2019附錄

A（資料性附錄）圖

A.1

體外重組

角膜模型組織學(xué)結(jié)構(gòu)圖（）T/SHRH

024-2019附錄

B（資料性附錄）溶液的配制1.

X-100（0.3%，）溶液的配制使用排代式移液器吸取

3

至

99