急性吸入毒性試驗 急性毒性分類法

附件194急性吸入毒性試驗急性毒性分類法AcuteInhalationToxicity-AcuteToxicClassMethod1范圍本試驗方法規(guī)定了急性吸入毒性試驗急性毒性分類法的試驗原則、試驗方法、數(shù)據(jù)和報告。本試驗方法適用于化妝品原料急性吸入毒性的急性毒性分類。本試驗方法適用于單一成分的化妝品原料，非單一成分的原料若使用本方法進行評價，需要提供更多的科學依據(jù)說明其可行性。本試驗方法不適用于測試某些特殊的材料，如難溶的等軸狀（isometric）或纖維狀（fibrous）材料、或人造納米材料（manufacturednanomaterials）。2試驗目的本試驗方法的目的是通過測試獲得受試物的健康危害信息等資料，從而可參考聯(lián)合國全球化學品分類和標簽管理協(xié)調(diào)制度（theUnitedNations（UN）GloballyHarmonizedSystem（GHS）ofClassificationandLabellingofChemicals）的化學品急性毒性分類標準對其急性毒性進行分類。3定義3.1急性吸入毒性分類法按照一定的連續(xù)試驗步驟和相應的濃度進行測試，從而獲得受試物的毒性分類和半數(shù)致死濃度（LC50,LethalConcentration50%）估測范圍的試驗方法。3.2計算濃度nominalconcentration使用受試物的量除以通過染毒系統(tǒng)空氣的總體積所得到的濃度。3.3實際濃度actualconcentration在吸入式染毒柜中動物呼吸道中的受試物濃度，可通過特異性（如直接采樣、吸附或化學反應等方法進行采樣、分析）或非特異性（如濾膜增重法）等方法進行測試分析。4試驗原則本試驗采用分步試驗的方法，觀察試驗動物暴露4h的反應，從而得到滿足對受試物急性吸入毒性等級進行分類的信息。為了特殊的監(jiān)管目的也可采用其他暴露時限（不是4h）的試驗。每步試驗使用每種性別3只動物，在確定的濃度下進行吸入暴露試驗。根據(jù)動物死亡和/或瀕死狀態(tài)，有時只進行2步試驗操作就可以對受試物的急性吸入毒性類別做出判斷。如果有證據(jù)表明某種性別的動物比另外一種動物的敏感性要高時，可以只使用敏感性別動物進行試驗。前面一步操作的試驗結(jié)果決定著下一步試驗操作：a）無需進行下一步試驗；b）每性別3只動物；或c）只使用6只敏感性別的動物。方法是每個試驗濃度組使用6只敏感性別的動物，性別不限，以估測的毒性類別界限范圍數(shù)值中較低的濃度來進行試驗。對瀕臨死亡的、處于難以忍受疼痛的或嚴重持久痛苦的動物，應人道地處死。人道處死的試驗動物，在結(jié)果統(tǒng)計時應與試驗中死亡的動物一并對待。5試驗方法5.1方法描述5.1.1動物種屬的選擇應使用健康年輕、實驗室中常用的種屬動物進行試驗。首選大鼠，如使用其他動物應進行論證，說明理由和依據(jù)。5.1.2動物的準備雌性動物應是未經(jīng)產(chǎn)的、未妊娠。要保證每步試驗暴露時的鼠齡在8W~12W；試驗開始時動物體重的差異應不超過平均體重的±20%。采用隨機選擇原則，并對每只動物做出標記。在進行試驗之前至少要在籠內(nèi)飼養(yǎng)5d以適應實驗室飼養(yǎng)條件。試驗前還需在試驗設備中進行短期的適應訓練，以減少因為進入新的設備環(huán)境造成的應激反應。5.1.3飼養(yǎng)條件實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。選用標準配合飼料，飲水不限制。實驗動物暴露前后按性別、濃度分籠飼養(yǎng)，但是每籠動物的數(shù)量不能妨礙對每只實驗動物的觀察，并應減少由于同種相殘和相互撕咬而造成實驗動物信息的丟失。以口鼻式裝置暴露時，需將動物放入固定管內(nèi)使其適應固定管的環(huán)境。固定管不能過度的增加動物體力、熱量和活動的負荷。動物的限制固定可能影響動物的體溫（過熱）和/或每分鐘動物呼吸量。如果有資料表明這些改變沒有達到可感覺到的程度，就不一定需要預先在固定管內(nèi)進行適應操作。全身暴露氣溶膠的動物在暴露期間需各自相隔互不接觸，防止柜體內(nèi)動物的相互趴臥造成被毛對氣溶膠的過濾作用。除暴露期間外（暴露期間禁食），給予實驗動物常規(guī)檢驗合格的飼料，自由飲水。采用人工照明，每12h明暗交替。5.1.4吸入染毒裝置要根據(jù)受試物的性質(zhì)和試驗目的來選擇吸入染毒方式。首選的染毒方式是口鼻式（nose-only）暴露（其中包括僅頭部暴露、鼻部暴露或口鼻部暴露三種染毒模式）。當受試物是液體、固態(tài)氣溶膠和能產(chǎn)生氣溶膠的蒸氣時，首選口鼻式暴露方式。對于特殊的研究目的，也可采用全身暴露（whole-body）的染毒方式以更好地滿足研究需求，但應在試驗報告中予以闡釋說明。為了保證全身染毒時柜體內(nèi)空氣中受試物的穩(wěn)定性，實驗動物的總體積不應超過染毒柜總?cè)莘e的5%。5.2暴露條件5.2.1染毒濃度5.2.1.1推薦暴露吸入時間為4h，但需除去達到濃度穩(wěn)定平衡所需時間。根據(jù)特殊試驗需要也可采用其他的暴露時限，但是需在試驗報告中給予說明。全身暴露時動物應各自隔離互不接觸，防止染毒柜內(nèi)其他動物的理毛行為造成經(jīng)口攝入受試物。吸入暴露期間需要禁食。全身暴露時可提供飲水。5.2.1.2動物吸入暴露的受試物是氣體、蒸氣、氣溶膠或是它們的混合物。試驗時將受試物制備成何種物態(tài)，取決于受試物的理化性質(zhì)、設定的濃度，和/或在實際加工應用中最有可能使用的物理狀態(tài)等。具有吸濕性的和會發(fā)生化學反應的受試物在試驗中需保證吸入的空氣是干燥的。需注意避免使用發(fā)生爆炸的濃度進行試驗。5.2.2顆粒粒徑的分布對所有的氣溶膠和可能形成氣溶膠的蒸氣都需測定顆粒粒徑的大小。為了使整個呼吸道都能暴露受試物，推薦的氣溶膠顆粒的質(zhì)量中值空氣動力學直徑（MassMedianAerodynamicDiameter，MMAD）為1μm~4μm，其幾何標準差為1.5~3.0。需盡可能達到此標準，如技術(shù)上無法滿足要求時需由專家做出評判。例如，金屬煙塵比本標準的粒徑要小，但是帶電的粒子、纖維和吸濕性受試物（在呼吸道潮濕環(huán)境下其粒徑增加）可超過這個標準。5.2.3溶媒選擇與受試物的配制為了制備具有合適濃度和粒徑大小的受試物，需要使用載體溶媒，作為一條規(guī)定，水是首選的載體溶媒。顆粒物需要機械加工達到要求的粒徑大小，但要注意加工中是否引起受試物的分解和變性。如機械加工改變了受試物的組成成分（如由于過度研磨、摩擦產(chǎn)生高溫），受試物的組成要經(jīng)過檢測分析進行確認。需注意不要污染受試物。對不能形成可吸入性的、不易成為粉末的顆粒材料不需要進行試驗。磨損試驗是用來證明加工這些材料時會不會產(chǎn)生呼吸性顆粒物。如果經(jīng)磨損試驗證實可產(chǎn)生呼吸性顆粒物，則該材料應當進行吸入毒性試驗。5.2.4對照組不需要設立平行陰性（空氣）對照。即使制備試驗氣體的載體溶媒不是水，也只有在沒有載體溶媒歷史數(shù)據(jù)的情況下才設立溶媒對照組。如果所用溶媒制備的受試物沒有引起毒性，至少說明在該受試物濃度的條件下，溶媒是沒有毒性的，所以不需要設立溶媒對照組。5.3暴露條件的監(jiān)測5.3.1染毒裝置內(nèi)氣流通過染毒柜（裝置）的氣流速率需嚴格控制，可連續(xù)在線監(jiān)測記錄或每次暴露期間至少每小時監(jiān)測記錄一次。試驗所用空氣中受試物濃度（或其穩(wěn)定性）的監(jiān)測數(shù)據(jù)是對染毒系統(tǒng)中各個動力學參數(shù)作用的綜合結(jié)果，因此這些數(shù)據(jù)可提供控制制備動態(tài)空氣設備相關參數(shù)的間接方法。在口鼻式染毒時通過染毒系統(tǒng)的試驗氣體的氣流動力不足時，需注意動物的在染毒裝置內(nèi)發(fā)生重復吸入。已有確定在所選定的操作條件下不會發(fā)生重復吸入的方法。氧氣的濃度至少為19%；二氧化碳的濃度不超過1%。如果證實確實不能達到這個標準，需要測定并記錄試驗空氣中氧氣和二氧化碳的濃度。5.3.2染毒裝置柜內(nèi)溫度和相對濕度染毒柜內(nèi)溫度維持在22℃±3℃?？诒鞘奖┞逗腿肀┞抖夹璞O(jiān)測記錄動物呼吸帶的相對濕度，在吸入染毒的4h之內(nèi)至少3次；吸入染毒暴露期限較短的試驗可以每小時監(jiān)測記錄1次。理想的相對濕度需維持在30%~70%；但是有時很難達到（如受試物以水配制），或者受試物與測定方法發(fā)生干擾而難以測定。5.3.3受試物5.3.3.1計算濃度無論何時都應盡量記錄并計算染毒柜空氣中受試物的計算濃度。計算濃度是指制備產(chǎn)生的受試物的量除以通過染毒系統(tǒng)的空氣總體積得到的參數(shù)。雖然計算濃度不是用來描述動物暴露特征，但是可通過計算濃度與實際濃度進行比較可以得到試驗系統(tǒng)制備效率的指征，從而可發(fā)現(xiàn)制備染毒空氣過程中存在的問題。5.3.3.2實際濃度5.3.3.2.1實際濃度是吸入染毒柜內(nèi)動物呼吸道中的受試物的濃度，可以通過特異性的方法（如采用吸附或化學反應的原理直接采樣，然后進行分析）；或是通過非特異性的方法（如濾膜增重法）來獲得。單一成分的粉末、低揮發(fā)性液體的氣溶膠才能使用增重法，同時還需要專門預試驗數(shù)據(jù)的支持。對多成分的粉末氣溶膠也可以用增重分析法測量，但是這需要證實所制備的空氣與最初受試物的組成成分相似。如果沒有此類數(shù)據(jù)資料，則需在試驗期間按照規(guī)定的時間間隔對制備產(chǎn)生的空氣進行再分析（理想的是染毒柜中的空氣）。對可揮發(fā)的或易升華的氣溶膠，需證實所用方法能收集到所有物相的受試物。需在試驗報告中報告靶濃度（目標濃度）、計算濃度和實際濃度，但只有實際濃度可用來計算致死濃度值。5.3.3.2.2應使用同一批試驗受試物。技術(shù)可行時盡可能將試驗樣品保存在能維持純度、均勻性和穩(wěn)定性的條件下。開始試驗前對受試物的特征有充分的了解和描述，如純度、鑒別特征和鑒定出來的污染物和雜質(zhì)。這可用以下參數(shù)來證實，如保留時間、相對峰面積和通過質(zhì)譜、氣相色譜或其他的檢測方法得到的分子量，包括且不限于以上內(nèi)容。雖然受試物樣品的特征鑒別不是實驗室的責任，實驗室還是需要對委托方提供的受試物進行必要的簡單有限的描述（如顏色、物理狀態(tài)等）。5.3.3.2.3需盡可能的保持染毒空氣成分穩(wěn)定，可采用適當?shù)姆治龇椒ㄟB續(xù)或間隔采樣監(jiān)測。間隔采樣時，吸入染毒4h的試驗至少采樣2次。如果由于系統(tǒng)內(nèi)染毒空氣流量過低所限，或染毒濃度太低需采集較多的空氣樣本時而不能完全滿足連續(xù)或間隔采樣量的要求，可在整個暴露期內(nèi)只采集一個樣本。如果樣本與樣本之間出現(xiàn)明顯波動，進行下一個濃度試驗時需在暴露期間采集4個樣本進行分析。染毒空氣各個樣本之間的濃度波動范圍應符合規(guī)定，氣體和揮發(fā)性受試物濃度范圍不得超過平均濃度±10%，液體或固體氣溶膠濃度范圍不得超過平均值±20%。并需要計算柜內(nèi)空氣受試物達到平衡時的時間（T95）。一個暴露周期內(nèi)需要考慮到制備受試物空氣的時間和達到T95的時間。對組成非常復雜混合物的蒸氣/氣體、氣溶膠（如推動終端裝置設備產(chǎn)生的燃燒空氣和試驗物形成的）在染毒柜內(nèi)空氣中每一相成分物相各不相同，至少要選擇一個標志性物質(zhì)來進行分析，通常是受試制備物中處在某一物相（蒸氣/氣體或氣溶膠）的主要的活性物質(zhì)。如果試驗物質(zhì)是制劑（商品形式的產(chǎn)品）分析報告的濃度應是制劑的總濃度，不是活性成分的或某成分的濃度。5.3.3.3顆粒物粒徑的分布氣溶膠的粒徑大小需在染毒的4h期間至少測定2次，方法是使用級聯(lián)撞擊采樣器或其他替代的設備如空氣動力學粒徑儀等。如果級聯(lián)撞擊時采樣器與替代的測定方法所得到的結(jié)果相同，在整個試驗期間的就可以使用替代的方法進行監(jiān)測。如采用濾膜增重或塵埃測定器/氣體發(fā)泡收集管等第二種設備檢測，則需要與基礎檢測設備進行平行試驗，以驗證基礎檢測設備的收集效率。粒徑大小分析得到的質(zhì)量濃度應與采用濾膜分析法得到的質(zhì)量濃度在一個合理的限度之內(nèi)。如果在試驗開始階段就證明兩種試驗方法的質(zhì)量濃度相同，就可以免去驗證性試驗。從動物福利方面考慮，需采取措施減少無確定結(jié)果的數(shù)據(jù)資料，因為這會要求重復進行暴露試驗。如果空氣中的蒸氣受試物能發(fā)生凝結(jié)而形成氣溶膠，或者染毒蒸氣空氣中測定到顆粒物也就是暴露空氣存在潛在的混合相，則需對這種受試物進行粒徑的測定。5.4操作步驟5.4.1正式試驗（maintest）5.4.1.1每一步使用雌雄各3只動物，或6只敏感性別的動物。如果采用口鼻式暴露方式時使用的嚙齒類動物不是大鼠，則需要調(diào)整最長的暴露時間以減少動物種屬之間的負荷的差異?？蓮?個固定的起始濃度水平染毒，這個濃度應能引起染毒動物中的某些動物出現(xiàn)毒性作用。氣體、蒸氣和氣溶膠的試驗步驟圖（見7試驗步驟流程圖）的濃度水平是GHS第1類~4類的分類標準的界限值：氣體為（100ppm/4h、500ppm/4h、2500ppm/4h、20000ppm/4h）（見圖1）；蒸氣為（0.5mg/L/4h、2mg/L/4h、10mg/L/4h、20mg/L/4h）（見圖2）；氣溶膠為（0.05mg/L/4h、0.5mg/L/4h、1mg/L/4h、5mg/L/4h）（見圖3）。高于各相應物態(tài)類別的上限濃度就歸為第5類。按照各自的試驗圖表來確定起始濃度。根據(jù)人道處死和動物試驗死亡的數(shù)量，按照圖中的指示的箭頭來決定下一步的試驗，直到能對受試物作出毒性分類時結(jié)束試驗。5.4.1.2進行下一個暴露濃度組試驗的時間間隔長短要根據(jù)毒性體征的發(fā)作時間、持續(xù)時間和嚴重程度來決定。決定進行暴露下一個濃度水平需要直到前一個濃度水平的動物存活狀態(tài)完全確定下來后再進行。建議的每個濃度水平之間的時間間隔為3d至4d，這可以觀察到可能存在的遲發(fā)毒性。如出現(xiàn)的反應不能確定，可適當調(diào)整時間間隔的長短。5.4.2限度試驗（limittest）5.4.2.1如已知或預期受試物幾乎無毒時可進行限度試驗，如在超過規(guī)定的極限濃度值以上時才引起毒性反應的受試物。受試物的毒性的信息可從已經(jīng)檢測的類似化合物、混合物或產(chǎn)物結(jié)果得到，此時要考慮到已知的具有毒理學意義的受試物的特性、混合物構(gòu)成的百分比等。在沒有或毒性信息很少的情況下，或者是估計受試物是具有毒性，需進行正式試驗。5.4.2.2正常的操作程序下，使用每種性別動物3只，或使用6只敏感性別的動物，暴露水平分別是：氣體20000ppm；蒸氣20mg/L；粉塵/霧5mg/L（如果技術(shù)可達到）。受試物制備成氣溶膠時，粒徑的大小需達到可呼吸性粒子的大?。ㄈ鏜MAD為1μm~4μm）。絕大部分的受試物都能在2mg/L的濃度水平進行試驗。如進行高于2mg/L濃度水平的氣溶膠試驗，受試物應能夠制備成可呼吸性粒子大小。從動物福利方面考慮，GHS不主張超過限度濃度的試驗。5.4.2.3只在有可能直接涉及到人類健康需要的情況下才進行GHS中第5類物質(zhì)濃度水平的試驗，并需在試驗報告中論述理由。對潛在爆炸性受試物試驗設計時要認真研究避免引起發(fā)生爆炸的條件出現(xiàn)。為了避免不必要的使用動物，開始限度試驗前，需在染毒系統(tǒng)不放置動物的條件下進行預試驗，以確認染毒條件是否能達到限度試驗的水平。5.4.3觀察5.4.3.1暴露期間要對實驗動物經(jīng)常進行臨床觀察。暴露染毒結(jié)束后的當日至少要觀察2次，還可根據(jù)動物對染毒的反應增加觀察次數(shù)；此后的14d內(nèi)至少每日觀察1次。觀察期期限的長短不是固定不變的，需要根據(jù)臨床癥狀出現(xiàn)的性質(zhì)、時間以及體征消失的長短來決定。毒性體征出現(xiàn)和消失的時間是十分重要的，應特別注意是否存在毒性體征延遲出現(xiàn)的傾向，對每只動物的所有的觀察都要分別作系統(tǒng)的記錄。5.4.3.2對處于瀕死的動物和表現(xiàn)出嚴重的疼痛和/或持續(xù)的嚴重痛苦的動物從動物福利考慮要人道的處死。對最初出現(xiàn)的微弱的毒性體征和由于暴露操作引起的短暫的呼吸道的異常改變等臨床體征要認真分析區(qū)別，不要錯誤認為這些都是染毒處理引起的毒性作用。要按照列在人道觀察終點的指南文件中“人道終點”的原則和標準進行操作。對人道處死的或發(fā)現(xiàn)已經(jīng)死亡的動物處死和死亡時間要盡可能的準確的記錄。籠外觀察包括動物皮膚和被毛、眼和粘膜、呼吸、循環(huán)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改變，以及身體活動和行為方式等變化。盡可能的注意局部作用與系統(tǒng)作用之間的任何差別。關注點主要為顫動、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡、睡眠和昏迷。測定直腸溫度或許可為是否存在對實驗動物的處理或在固定管內(nèi)過度的限制造成反射性呼吸過緩、體溫過低或過高等提供證據(jù)。5.4.4體重進入實驗室適應環(huán)境期間每只動物至少要稱重一次；染毒當日，在開始試驗前（第0d）、染毒后的1d、3d、7d（此后每周記錄一次）、死亡時和染毒后超過1d以后人道處死的動物都要稱量每只動物的體重。體重變化是判定毒性作用的指標，并且對于體重持續(xù)低于染毒前體重的20%要給予密切觀察。試驗結(jié)束時存活動物稱量體重后并人道地處死。5.4.5病理學所有實驗動物，包括試驗期間死亡的、人道處死的動物和動物福利考慮從試驗隊列中退出的，都需進行大體解剖檢查。如果動物死亡后不能立即進行解剖檢查，應將死亡動物放入冰箱的冷藏箱內(nèi)低溫存放，以減少動物尸體的自溶分解。大體尸檢應在死亡后1d~2d進行。每只動物大體解剖所見的病理學改變都記錄，特別注意呼吸道出現(xiàn)的任何變化。其他輔助的檢查，包括可能對試驗結(jié)果做出解釋的檢查指標，如測定存活大鼠的肺臟重量或者對呼吸道進行顯微檢查以提供受試物刺激性的證據(jù)等。檢查的器官涉及到染毒后存活24h以上的動物出現(xiàn)大體解剖學改變的器官、或者已知或預期可能受到影響的器官。全呼吸道的顯微組織學檢查或許可為鑒定受試物是否與水發(fā)生反應提供非常有價值的信息，如酸類和吸濕性的受試物。6數(shù)據(jù)和試驗報告6.1數(shù)據(jù)需提供每只動物的體重、大體解剖檢查所見的全部資料。臨床觀察的數(shù)據(jù)需要總結(jié)成表格的形式，包括能表現(xiàn)出每個試驗組使用的動物數(shù)、出現(xiàn)特異性毒性體征的動物數(shù)、試驗期間死亡或人道處死的動物數(shù)、每只動物的死亡時間、詳細描述毒性作用的發(fā)生、發(fā)展的時間進程和體征的可逆性；大體解剖所見。6.2試驗報告試驗報告需包括以下信息：實驗動物和飼養(yǎng)條件：—飼養(yǎng)籠具的描述：每籠動物的數(shù)量（或動物變化的數(shù)量）、墊料、環(huán)境溫度、相對濕度、光照周期、飼料合格認證資料；—使用的動物種屬和品系，不使用大鼠進行試驗的論證依據(jù)；—動物的數(shù)量、周齡和性別；—隨機選擇分組的方法；—動物食物、飲水的質(zhì)量（包括飼料的類型/來源和供水的來源）；—試驗前的所有的包括飼料、檢疫、疾病的處理等描述。受試物：—物理性狀、純度、相關的理化性質(zhì)（包括同分異構(gòu)體）；—受試物特征性數(shù)據(jù)和化學文摘（CAS）注冊號（如果已知）。溶媒:—如果不是用水作為載體溶媒，所用的溶媒是什么，對采用這種溶媒的理由作出論述；—可證明所使用的溶媒不會干擾研究結(jié)果的既往歷史數(shù)據(jù)或平行對照數(shù)據(jù)。吸入染毒裝置：—吸入染毒裝置的描述包括大小尺度和體積；—除了描述制備染毒空氣操作外，還需動物暴露所用設備及其來源進行描述；—測定氣溫、濕度、粒徑大小和實際濃度的儀器設備；—空氣的來源、空氣供給/解壓處理、調(diào)節(jié)供給條件所使用的系統(tǒng)；—確保試驗空氣均勻所使用的調(diào)節(jié)設備和方法；—壓差（正壓或負壓）；—每個吸入裝置動物暴露孔的數(shù)量（口鼻式染毒裝置）；每個染毒裝置容納動物的格位數(shù)量（全身染毒裝置）；—試驗時空氣中受試物的均勻性、穩(wěn)定性；—溫度和濕度感受器、采樣孔所在的部位；—空氣流速，包括口鼻式固定孔處的空氣流速、全身染毒柜內(nèi)放置動物處的空氣流速；—如果測定了空氣中氧氣和二氧化碳需要提供所用設備的信息；—達到吸入染毒柜空氣濃度穩(wěn)定平衡的時間（T95）；—每小時空氣體積更換次數(shù)；—計量儀器設備。暴露數(shù)據(jù)：—正式試驗中選擇設定靶濃度的理由；—計算濃度（制備的試驗物質(zhì)進入到吸入染毒設備的總量除以通過染毒柜空氣的總體積）；—從動物呼吸道中采樣測得的受試物的實際濃度；對制備受試物中形成不同物態(tài)的混合物（氣體、蒸氣和氣溶膠），需分別對每一物態(tài)進行測定；—報告中所有的空氣濃度都要用質(zhì)量單位（如mg/L，mg/m3等）來表示，當然也可以用體積單位來報告；—顆粒物粒徑大小的分布用MMAD和幾何標準差來表示，同時列出得到這個參數(shù)的計算方法。應在報告中記錄每個檢測到的粒徑大小的數(shù)據(jù)。試驗條件:—受試物制備的詳細操作，包括固態(tài)物質(zhì)被制備成為直徑更小的顆粒物或制備成溶液的詳細操作過程；—如機械加工時改變了受試物的組成成分，還要提交加工后受試物組成成分的檢測分析的結(jié)果；—制備試驗空氣所用設備和制備動物染毒試驗空氣操作的描述（可以用示意圖表示）；—所用化學分析方法的詳細描述和分析方法的可靠性的詳細描述（包括從空氣媒介樣品中受試物的回收率）；—設定選擇試驗濃度的理由和根據(jù)。結(jié)果：—列表表示染毒裝置內(nèi)空氣環(huán)境的溫度、濕度和流速；—列表表示染毒空氣中計算濃度、實際濃度數(shù)據(jù)；—列表表示顆粒粒徑大小的數(shù)據(jù)，包括樣本的采集測試方法、粒徑大小的分布、MMAD及幾何標準差的計算等；—列表表示動物出現(xiàn)毒性反應的數(shù)據(jù)和每只動物暴露濃度水平（如死亡、正常、嚴重程度和作用的持續(xù)時間等毒性體征的動物數(shù)量）；—試驗中收集到的每只動物的體重、計劃試驗結(jié)束人道處死前動物死亡的日期和時間、毒性體征出現(xiàn)的時間和過程，以及每只動物出現(xiàn)的毒性體征是否是可逆的等；—每只動物大體解剖和組織病理學檢查（如果進行了組織學檢查）所見；—受試物按照急性吸入毒性（GHS）分類屬于哪類和LC50界限值。討論和結(jié)果分析：—需要特別強調(diào)的是所有方法的描述要達到本方法規(guī)定的標準，如限度濃度試驗和顆粒粒徑大小的規(guī)定；—應根據(jù)總體調(diào)查結(jié)果處理顆粒的可吸入性，尤其是當無法滿足顆粒尺寸標準時；—從整個試驗所見可知制備受試物達到可呼吸性粒徑是至關重要的，要特別注意是不是未能達到顆粒粒徑大小的標準；—對測定計算濃