T-CPMA 027-2023 病原微生物菌（毒）種標準株 艾滋病病毒毒株建立技術規(guī)范

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學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載CCS

C

04

027—2023病原微生物菌（毒）種標準株

毒株建立技術規(guī)范Standard

strains

of

pathogenic

—technical

establishment

of

HIV

strains2023

-

02

–

02

2023

-

02

-

02

發(fā)

布學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

027—2023學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載 前言

.................................................................................

II1

...............................................................................

12 規(guī)范性引用文件

.....................................................................

13 術語和定義

.........................................................................

14 樣本要求

...........................................................................

25 分離培養(yǎng)和滴定要求

.................................................................

2分離培養(yǎng)

.......................................................................

2擴增培養(yǎng)

.......................................................................

2病毒滴定

.......................................................................

26 鑒定要求

...........................................................................

2基因型鑒定

.....................................................................

2表型鑒定

.......................................................................

37 評價要求

...........................................................................

3基本要求

.......................................................................

37.2 活性

...........................................................................

3穩(wěn)定性

.........................................................................

38 信息要求

...........................................................................

39 保藏要求

...........................................................................

310 質量控制和生物安全要求

............................................................

4附錄

A（規(guī)范性） HIV

毒株分離鑒定技術

.................................................

5A.1

毒株分離培養(yǎng)與滴定

..........................................................

5A.2

毒株基因型鑒定..............................................................

5A.3

毒株嗜性和合胞體誘導特性鑒定................................................

6附錄

B（規(guī)范性） HIV

標準株信息描述

...................................................

7參考文獻

..............................................................................

9學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

027—2023學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載 本文件按照GB/T

1.1—《標準化工作導則

第1草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心提出。本文件由中華預防醫(yī)學會歸口。國疾病預防控制中心。巖、吳昊。II學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

027—2023學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載

1 范圍量控制和生物安全的要求。斷等相關活動的機構可參照執(zhí)行。2 規(guī)范性引用文件文件。GB

19489—2008

實驗室生物安全通用要求GB/T

37864—2019

生物樣本庫質量和能力通用要求（ISO

20387：2018，IDT）WS

293—2019

艾滋病和艾滋病病毒感染診斷WS

315—2010

人間傳染的病原微生物菌（毒）種保藏機構設置技術規(guī)范WS/T

—2022

病原微生物菌（毒）種國家標準株評價技術標準T/CPMA

011—2020

病原微生物菌（毒）種保藏數(shù)據(jù)描述通則3 術語和定義WS

293—2019和WS

—2010界定的以及下列術語和定義適用于本文件。艾滋病病毒

human

immunodeficiency

virus；人免疫缺陷病毒導致艾滋病的病原體。[來源：WS

293—2019，

virus

strains可在體外培養(yǎng)、具有保藏價值、經(jīng)鑒定和分類并給予固定編號的病毒。

標準株

HIV

standard

具有HIV典型生物學特征，遺傳學特性得到確認和保證、可追溯，且具有HIV型及亞型的代表性,由保藏機構復核、鑒定，并給予固定編號的HIV毒株。以下簡稱標準株。

耐藥株

HIV

drug

resistant

strains攜帶耐藥基因突變、對抗反轉錄病毒藥物具有耐受性的HIV毒株。以下簡稱耐藥株。病毒滴度

virus

單位體積中感染性病毒的數(shù)量。50%50%

Infectious

TCID50。病毒載量

viral

load血漿（清）中

的數(shù)量。mL

HIV

CPs)學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

027—2023學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載

HIV-1的核心蛋白。HIV-1p24全長基因序列

full-length

genomic

sequence約9700bp的HIV全長核苷酸序列。

preservation3.10特性，并向合法從事病原微生物相關實驗活動的單位提供菌（毒）種或樣本的活動。[來源：WS

315—2010，，有修改]保藏機構

organization保藏中心、國家病原微生物保藏中心分中心和專業(yè)實驗室。[來源：WS

315—2010，，有修改]病毒嗜性

virus

HIV與宿主CD4+T細胞表面的CCR5或CXCR4輔助受體選擇性結合的生物學特性。合胞體誘導

syncytia

inducing；SIHIV感染導致細胞融合形成合胞體的過程。4 樣本要求

blood

mononuclear

，PBMC液、精液等用于HIV分離培養(yǎng)，應無菌采集。病毒分離培養(yǎng)上清液用于擴增、滴定、基因型及重組、表型、耐藥表型鑒定等檢測。5 分離培養(yǎng)和滴定要求分離培養(yǎng)分離毒株應采用HIV陰性健康人的PBMC與感染者的PBMC上清液的抗原濃度，判斷分離培養(yǎng)是否成功。檢測應符合的規(guī)定。擴增培養(yǎng)擴增培養(yǎng)應使用待擴增的培養(yǎng)上清液接種健康人，培養(yǎng)上清液的抗原濃度達到1ng/mL時，為擴增培養(yǎng)成功。病毒滴定測定的感染性滴度應采用終點稀釋法。6 鑒定要求基因型鑒定6.1.1 鑒定基因型應對

HIV

的

3

gag、pol

和

env應符合

A.2

的規(guī)定。6.1.2 根據(jù)病毒基因序列判斷基因型、基因重組和耐藥位點。學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載7.2.2 病毒滴度應不低于

50/mL。T/CPMA

027—2023學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載7.2.2 病毒滴度應不低于

50/mL。表型鑒定6.2.1 嗜性鑒定病毒培養(yǎng)上清液接種表達CCR5和/或CXCR4合A.3.3.1的規(guī)定。6.2.2 合胞體誘導鑒定病毒培養(yǎng)上清液接種MT-2細胞，觀察合胞體的形成，判斷是否為SI表型。檢測應符合A.3.3.2定。6.2.3 耐藥表型鑒定測定藥物對病毒的抑制濃度及其與野生型病毒相比增加的倍數(shù)，判斷耐藥表型。7 評價要求基本要求7.1.1 標準株的評價基本要求應符合

WS/T

812—2022。7.1.2 標準株的活性和穩(wěn)定性評價應經(jīng)至少兩家獨立實驗室驗證?；钚?.2.1 至少連續(xù)傳

3

代，可穩(wěn)定復制。5穩(wěn)定性7.3.1 傳代培養(yǎng)過程中應保持培養(yǎng)條件不變。培養(yǎng)細胞應使用

易感的原代細胞或細胞系；培養(yǎng)基應包括胎牛血清、抗生素等，支持易感細胞或細胞系的高效生長；培養(yǎng)環(huán)境應保持溫度

370.5CO2濃度

5％±0.1％，相對濕度

2.5％。7.3.2

gag、pol

和

env3

型結果一致。7.3.3 不同代次間耐藥株的耐藥位點和耐藥表型應穩(wěn)定，耐藥位點穩(wěn)定存在，藥物對病毒的

濃度無顯著統(tǒng)計學差異。7.3.4 不同代次間的病毒嗜性和合胞體誘導表型應穩(wěn)定，鑒定結果一致。8 信息要求信息應完整，包括基本信息、基物信息、特征信息、保存單位聯(lián)系信息。特征信息應明確，包含

抗原濃度、病毒滴度、基因型、耐藥基因型、病毒嗜性表型等?？筛饺L基因序列。傳代信息應明確，包括培養(yǎng)代次、周期和各代次收集時間等。如曾使用該毒株進行研究，應提供包括目的、方法和結果等信息。信息描述應符合

T/CPMA

—2020。HIV

標準株信息描述按照附錄

B

執(zhí)行。9 保藏要求標準株應在不同地點、設備或以不同方法備份保藏。應在液氮或-140℃以下深低溫冷凍保藏，對保藏設備及環(huán)境條件進行溫度監(jiān)控和記錄。標準株應有唯一編碼，保藏位置明確。樣本管標簽應在長期深低溫保藏條件下保持牢固和清晰。轉移標準株應執(zhí)行保藏機構的轉移程序。應減少轉移次數(shù)和凍融次數(shù)。應建立保藏信息系統(tǒng)，保藏、使用、庫存、銷毀等信息應清晰、可追溯。學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

027—2023學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載10 質量控制和生物安全要求定等在生物安全二級實驗室開展。實驗操作應符合

GB

19489—2008，實驗活動所需生物安全實驗室級別和運輸包裝分類見《人間傳染的病原微生物名錄》。2006

。標準株的建立、制備、保存、運輸、分發(fā)等環(huán)節(jié)應可溯源，按照

GB/T

37864—2019

室安全防護和質量保證見《全國艾滋病檢測技術規(guī)范（2020

年修訂版）》。分離培養(yǎng)、鑒定等關鍵技術方法應經(jīng)過確認和驗證，并制定標準操作程序。相關的檢測方法應參加權威機構組織的能力驗證或實驗室間比對。兔學兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

027—2023兔學兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載

附 錄 A（規(guī)范性）HIV

毒株分離鑒定技術A.1 HIV

毒株分離培養(yǎng)與滴定A.1.1 樣本分離培養(yǎng)首選HIV感染者的PBMC，也可使用新鮮抗凝全血、血漿、腦脊液、精液以及其他體液。滴定一般使用病毒培養(yǎng)上清液。A.1.2 試劑和設備2、植物血凝素、HIV-1

p24CO2全柜等。A.1.3 實驗方法分離培養(yǎng)HIV毒株采用健康人PBMC作為培養(yǎng)細胞。將感染者樣本與培養(yǎng)細胞共培養(yǎng)24周后，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測HIV-1

抗原濃度，終點稀釋法測定HIV的感染性滴度。A.1.4 結果判定A.1.4.1 病毒培養(yǎng)上清液的

HIV-1

p24

抗原連續(xù)

2

次呈陽性反應，且

抗原濃度升高，可判斷為分離培養(yǎng)成功。A.1.4.2 病毒培養(yǎng)上清液的

HIV-1

p24

抗原濃度達到

1

ng/mL

以上，可進行分裝、編號、凍存。A.1.4.3 將樣本系列稀釋后感染健康人

PBMC

或其他易感細胞系，培養(yǎng)并觀察細胞病變，測定

p24

抗原濃度，計算病毒滴度。A.1.5 質量控制病毒分離培養(yǎng)過程中應設立陰性對照，宜設立陽性對照。A.2 HIV

毒株基因型鑒定A.2.1 樣本HIV病毒培養(yǎng)上清液（見）。A.2.2 試劑和設備主要試劑包括核酸提取試劑、擴增試劑、

3個基因片段（gag、pol和env）的引物和探針、DNA測序試劑等。主要設備包括擴增儀、電泳儀、測序儀等。A.2.3 實驗方法A.2.3.1

提取病毒

RNA,進行逆轉錄反應合成

cDNA,對三個基因片段

gag、pol

和

env

PCR

擴增。A.2.3.2

對

PCR

擴增產(chǎn)物進行

DNA

測序，將測得的病毒基因序列進行清理和拼接。A.2.3.3

分析近似全長基因序列發(fā)現(xiàn)可能存在的基因重組。A.2.3.4

對

pol

基因序列分析時可關注耐藥位點。A.2.4 結果判定使用權威機構數(shù)據(jù)庫進行基因序列比對，通過基因遺傳距離分析鑒定毒株的基因型。A.2.5 質量控制學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

027—2023學兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載應使用已知基因亞型毒株的序列作為參考序列。A.3 HIV

毒株嗜性和合胞體誘導特性鑒定A.3.1 樣本HIV病毒培養(yǎng)上清液（見）。A.3.2 試劑和設備L-顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱和流式細胞儀。A.3.3 實驗方法A.3.3.1 嗜性測定病毒培養(yǎng)上清液加入表達CCR5和/或CXCR4的GHOST細胞，培養(yǎng)48

h后，檢測細胞的綠色熒光蛋白（green

，GFP）。A.3.3.2 合胞體誘導測定病毒培養(yǎng)上清液加入MT-2細胞培養(yǎng)，連續(xù)23周顯微鏡下觀察細胞融合現(xiàn)象。A.3.4 結果判定A.3.4.1 嗜性測定病毒感染的GHOST細胞與陰性對照相比，GFP熒光變化大于5倍時，可判定為陽性。感染CCR5細胞陽性的病毒是CCR5嗜性，感染CXCR4細胞陽性的病毒是CXCR4嗜性，兩種細胞均為陽性，則為雙嗜性病毒。A.3.4.2 合胞體誘導測定象，為非合胞體誘導（

syncytia

inducing,

）型毒株。A.3.5 質量控制應使用已知嗜性和合胞體誘導表型的毒株作為陽性對照。信息內(nèi)容示例

a基本信息中文名稱

b艾滋病病毒標準株英文名稱

bHIV

standard

資源庫編號NPRC

毒株保藏編號CHPC

原始編號

b304379數(shù)量和體積

b1mL/2

支毒株來源歷史

b←中國疾病預防控制中心病原微生物菌（毒）種保藏中心←中國醫(yī)科大學艾滋病研究所保藏時間2021-06-01分離時間

b2020-08-17分離地址

b中國遼寧省沈陽市和平區(qū)分離基物

bHIV

感染者

PBMC基物信息樣本描述

bHIV

感染者全血樣本采集時間

b2020-5-19樣本采集地址

b中國遼寧省沈陽市和平區(qū)HIV

感染者/艾滋病患者信息性別

b男年齡

b30臨床分期I

期（無癥狀期）感染途徑

b男男同性傳播診斷時間

b2020-5-19治療情況

b樣本采集時未治療檢測情況CD4+T

細胞絕對計數(shù)：

個/μL病毒載量：66900CPs/mL特征信息p24

抗原濃度

b10000pg/mL．ｃｘｗｚｆ．ｂｗｗ兔ｗ兔學ｏｍ標準下載T/CPMA

027—2023．ｃｘｗｚｆ．ｂｗｗ兔ｗ兔學ｏｍ標準下載

附 錄 B（規(guī)范性）HIV

標準株信息描述HIV標準株信息描述見表。表

表

B.1

HIV

標準株信息描述．ｃｘｗｚｆ學兔兔ｗｗｗ．ｂｏｍ標準下載10

TCID．ｃｘｗｚｆ學兔兔ｗｗｗ．ｂｏｍ標準下載10

TCID50/mL傳代信息

bb

T/CPMA

027—20235第

2

代，培養(yǎng)周期

11天收集基因型

b

CRF01_AE基因片段用于基因型鑒定的基因片段b

3

個基因片段（env、gag

和

pol）全長基因序列 無無耐藥位點（參考斯坦福耐藥數(shù)據(jù)庫耐藥基因型

b

/，2020年）耐藥表型 對

AZT、、

、3TC

和

均敏感合胞體誘導表型 非合胞體誘導型（）病毒嗜性表型

b

CCR5保存單位聯(lián)系信息

聯(lián)系人

張

XX聯(lián)系電