高效液相色譜在制藥行業(yè)中的應(yīng)用

關(guān)于高效液相色譜在制藥行業(yè)中的應(yīng)用第2頁,共69頁，2024年2月25日，星期天

北京創(chuàng)新通恒科技有限公司是一家面向全球的專業(yè)HPLC企業(yè)，主要致力于高效液相色譜系統(tǒng)研制、開發(fā)、生產(chǎn)和銷售。創(chuàng)建于2000年，公司總部位于北京市海淀區(qū)中關(guān)村高科技園區(qū)上地信息產(chǎn)業(yè)基地，是一家極具創(chuàng)造力的國家級高新技術(shù)企業(yè)。十年來一直秉承“精益求精，追求品質(zhì)，值得信賴”傳統(tǒng)，根據(jù)用戶需求，在用戶關(guān)鍵領(lǐng)域進(jìn)行持續(xù)的技術(shù)研發(fā)。我們擁有卓越的技術(shù)團(tuán)隊(duì)和專家級的一流研發(fā)人才，“CXTHDAC800工業(yè)化生產(chǎn)型HPLC系統(tǒng)”研發(fā)投產(chǎn)，將中國工業(yè)化色譜系統(tǒng)推向世界前列，這是中國大型純化分離研發(fā)領(lǐng)域的一座里程碑；“CXTHKilotide500DNA合成儀”投入使用，彌補(bǔ)中國大型合成設(shè)備領(lǐng)域的空白。

關(guān)于我們第3頁,共69頁，2024年2月25日，星期天國家級高新技術(shù)企業(yè)國家級軟件產(chǎn)品企業(yè)創(chuàng)新通恒科學(xué)技術(shù)部技術(shù)創(chuàng)新基金國家級、北京市創(chuàng)新基金關(guān)于我們第4頁,共69頁，2024年2月25日，星期天軟件著作權(quán)7項(xiàng)儀器儀表協(xié)會(huì)創(chuàng)新金獎(jiǎng)DAC800大型工業(yè)化制備色譜系統(tǒng)BCEIA金獎(jiǎng)發(fā)明專利3項(xiàng)，實(shí)用新型專利13項(xiàng)公司資質(zhì)、獎(jiǎng)項(xiàng)第5頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共69頁，2024年2月25日，星期天北京創(chuàng)新通恒科技有限公司北京鋼臣科技有限公司總經(jīng)理辦公室開發(fā)部財(cái)務(wù)部營銷事業(yè)部中小設(shè)備加工中心應(yīng)用技術(shù)發(fā)展部工業(yè)化設(shè)備加工中心上海辦事處成都辦事處廣州辦事處售后技術(shù)支持中心組織構(gòu)架第7頁,共69頁，2024年2月25日，星期天走近我們第8頁,共69頁，2024年2月25日，星期天引言：HPLC的特點(diǎn)HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用藥物色譜分析方法的開發(fā)藥物色譜純化方法的建立和優(yōu)化：從分析到工業(yè)制備目錄內(nèi)容提要第9頁,共69頁，2024年2月25日，星期天引言HPLC的特點(diǎn)：高效：分離效能高高靈敏度應(yīng)用范圍廣：70%以上的有機(jī)化合物可以用HPLC分析分析速度快條件溫和，樣品不被破壞分析HPLC由于靈敏度高，快速簡便，廣泛地應(yīng)用于藥物分析制備HPLC是目前分離與純化領(lǐng)域中處理多組分復(fù)雜體系的最有效的方法第10頁,共69頁，2024年2月25日，星期天引言：HPLC的特點(diǎn)HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用藥物色譜分析方法的開發(fā)藥物色譜純化方法的建立和優(yōu)化：從分析到工業(yè)制備目錄內(nèi)容提要第11頁,共69頁，2024年2月25日，星期天分析型HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用檢測藥物含量天然藥物化學(xué)成分復(fù)雜，有效成分可能有一個(gè)，也可以有多個(gè)，因此精確測定各有效成分的含量對藥品質(zhì)量控制，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要的意義。高效液相色譜法由于其專一性、靈敏度高、快速簡便的特點(diǎn)可廣泛應(yīng)用于藥物分析中的定量分析，尤其在干擾因素見多的時(shí)候表現(xiàn)出更大的優(yōu)越性。藥效檢測：藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，新藥效能研究檢測藥物殘留第12頁,共69頁，2024年2月25日，星期天三七藥材組分分析：第13頁,共69頁，2024年2月25日，星期天感冒清熱顆粒中的葛根素有效成分分析：第14頁,共69頁，2024年2月25日，星期天

第15頁,共69頁，2024年2月25日，星期天

第16頁,共69頁，2024年2月25日，星期天

第17頁,共69頁，2024年2月25日，星期天半制備型HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用高通量篩選活性物質(zhì)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模純化（克級）第18頁,共69頁，2024年2月25日，星期天DISCOVERYACTIVECOMPONENT發(fā)現(xiàn)活性高通量篩選活性物質(zhì)第19頁,共69頁，2024年2月25日，星期天中藥提取物或發(fā)酵液等的分析譜圖哪個(gè)才是活性組分？高通量篩選活性物質(zhì)第20頁,共69頁，2024年2月25日，星期天用半制備色譜系統(tǒng)，對可能具有生物活性的組分，多次進(jìn)樣，分段制備幾十毫克做活性研究，最終確定活性組分高通量篩選活性物質(zhì)第21頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共69頁，2024年2月25日，星期天制備HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用純化藥物有效成分高附加值產(chǎn)品（如紫杉醇、長春堿等癌癥治療藥物）上樣量大，附加值低產(chǎn)品（甜菊糖苷等附加值低的藥物輔料）工藝改進(jìn)類產(chǎn)品（增大生產(chǎn)量或提高產(chǎn)品純度類產(chǎn)品）第23頁,共69頁，2024年2月25日，星期天制備HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用第24頁,共69頁，2024年2月25日，星期天

小試級制備色譜系統(tǒng)：方法的放大及標(biāo)準(zhǔn)品、對照品的制備。第25頁,共69頁，2024年2月25日，星期天中試級制備色譜系統(tǒng)：年產(chǎn)公斤級至百公斤級第26頁,共69頁，2024年2月25日，星期天DAC800型工業(yè)化色譜：

年產(chǎn)噸級第27頁,共69頁，2024年2月25日，星期天引言：HPLC的特點(diǎn)HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用藥物色譜分析方法的開發(fā)藥物色譜純化方法的建立和優(yōu)化：從分析到工業(yè)制備目錄內(nèi)容提要第28頁,共69頁，2024年2月25日，星期天液相色譜實(shí)驗(yàn)所需的基本參數(shù)流動(dòng)相：種類及配比，等度或梯度固定相：色譜柱類型及內(nèi)徑、長短流動(dòng)相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測器參數(shù)溫度控制進(jìn)樣量以上參數(shù)即構(gòu)成一個(gè)具體的HPLC方法；亦稱色譜條件藥物色譜分析方法的開發(fā)第29頁,共69頁，2024年2月25日，星期天高壓輸液泵的選擇平流（單泵）高壓梯度使用多臺(tái)色譜泵，在泵后混合配置靈活、簡單，脫氣簡單低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前混合對脫氣要求高第30頁,共69頁，2024年2月25日，星期天檢測器的選擇a、紫外可見光檢測器應(yīng)用最廣泛的檢測器，是在UV及VIS區(qū)有吸收物質(zhì)檢測的首選檢測器。b、示差折光檢測器一種通用型的檢測器，靈敏度偏低，對溫度穩(wěn)定性要求過高，不能用于梯度洗脫。通常用來分析糖類及高聚物（GPC）c、熒光檢測器靈敏度極高，常用來進(jìn)行痕量檢測。d、二極管陣列檢測器（DAD）可用于全波長的檢測，可以測量峰純度，可在線得到色譜圖和光譜圖。e、蒸發(fā)光散射檢測器一種通用型檢測器，它可以檢測揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品。ELSD可以用于測量無生色團(tuán)物質(zhì)的檢測，如碳水化合物、類脂物、聚合物、不進(jìn)行衍生化的脂肪酸及氨基酸、表面活性劑及結(jié)構(gòu)不明又無標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)的檢測。第31頁,共69頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)分離模式劃分的色譜柱類型色譜柱的選擇第32頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共69頁，2024年2月25日，星期天常用色譜柱類型1.ODS（C18）—應(yīng)用范圍最廣的填料，大部分小分子有機(jī)化合物都可進(jìn)行分析2.C8、C4—保留要比C18弱，適合用于大分子的多肽和蛋白類的分離純化3.氨基柱—正反雙模式，主要用于小分子糖類化合物4.苯基柱—通常用于分離含苯環(huán)的化合物5.氰基柱—正反雙模式，和ODS基不同的色譜間作用力，因而氰基柱擁有獨(dú)特的選擇性6.正向硅膠7.環(huán)糊精—根據(jù)物質(zhì)光學(xué)性質(zhì)的不同進(jìn)行手性分離第34頁,共69頁，2024年2月25日，星期天進(jìn)樣系統(tǒng)的選擇

六通進(jìn)樣閥六通閥的構(gòu)造a.Load狀態(tài)b.Inject狀態(tài)

自動(dòng)進(jìn)樣器第35頁,共69頁，2024年2月25日，星期天為保證重現(xiàn)性以及峰形等，很多情況下需要使用柱溫箱來控制柱溫。選配：恒溫裝置第36頁,共69頁，2024年2月25日，星期天引言：HPLC的特點(diǎn)HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用藥物色譜分析方法的開發(fā)藥物色譜純化方法的建立和優(yōu)化：從分析到工業(yè)制備目錄內(nèi)容提要第37頁,共69頁，2024年2月25日，星期天藥物色譜純化方法的建立和優(yōu)化：從分析到工業(yè)制備理論的放大設(shè)備的放大第38頁,共69頁，2024年2月25日，星期天分析型色譜：線性色譜指組分在固定性和流動(dòng)相中的平衡濃度呈正比例關(guān)系，即吸附（分配）等溫線為一條直線。用于分離和鑒別樣品中的組分，為此希望能在盡可能小的進(jìn)樣量下，提供盡可能高的組分分辨率。制備色譜：非線性色譜在制備色譜中，進(jìn)樣量一般都比較大，例如在克量級范圍，這時(shí)樣品在流動(dòng)相和固定相中的比例不再是正比例的關(guān)系，相對應(yīng)的吸附（分配）等溫線將發(fā)生彎曲。用于分離、富集或純化混合物中的某一或某些組分，為此需要一定的處理量，一般進(jìn)樣量比分析型色譜大得多。能有適當(dāng)?shù)姆蛛x度，并要考慮層析分離過程的規(guī)模、速率和分離成本。理論的放大：非線性色譜第39頁,共69頁，2024年2月25日，星期天線性色譜分析制備非線性色譜理論的放大：非線性色譜第40頁,共69頁，2024年2月25日，星期天制備色譜峰型理論的放大：非線性色譜第41頁,共69頁，2024年2月25日，星期天色譜峰型不再對稱色譜峰的保留時(shí)間隨著進(jìn)樣濃度而變化色譜峰高度（峰面積）與進(jìn)樣濃度不成正比非線性色譜的特點(diǎn)理論的放大：非線性色譜第42頁,共69頁，2024年2月25日，星期天濃度超載進(jìn)樣體積超載進(jìn)樣PKLangmuir型容量因子降低，峰形從高斯曲線變?yōu)槿切翁岣邩悠返臐舛?，保持進(jìn)樣體積不變；取決于組分在流動(dòng)相中的溶解度峰高不變，峰變寬并呈矩形取決于進(jìn)樣體積，生產(chǎn)效率決定于制備柱直徑，需要小顆粒填料理論的放大：過載進(jìn)樣第43頁,共69頁，2024年2月25日，星期天理論的放大：過載進(jìn)樣第44頁,共69頁，2024年2月25日，星期天理論的放大：過載進(jìn)樣應(yīng)盡可能選用流動(dòng)相來溶解樣品，但應(yīng)注意樣品在流動(dòng)相中應(yīng)有良好的溶解度。同時(shí)，若樣品體積太大，分辨能力就會(huì)下降；若樣品過濃，則可能在柱的頂部形成沉淀。盡管如此，為每次可分離得到更多的樣品，還是應(yīng)在小體積的流動(dòng)相中溶解較多的樣品?？蓪悠啡苡诓煌诹鲃?dòng)相的溶劑，但用此法時(shí)需很謹(jǐn)慎。第45頁,共69頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備的放大：分析設(shè)備與制備設(shè)備分析制備應(yīng)用范圍定性、定量檢測樣品的組成定性分析：檢測的靈敏度定量分析：分離度、再現(xiàn)性從混合物中提取、分離、純化樣品樣品中特定成分的高純度獲取，大量、廉價(jià)的制備填料粒徑≤5um≥10um流速0.001-9.999ml/min100~80000ml/min進(jìn)樣量0.01-2mg1-500000mg管路1/16”1/8”~1/4進(jìn)樣方式進(jìn)樣閥進(jìn)樣閥或進(jìn)樣泵流動(dòng)相不回收回收分離方式線性非線性第46頁,共69頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備的放大：分析設(shè)備與制備設(shè)備第47頁,共69頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備的放大：分析設(shè)備與制備設(shè)備更大的容器：儲(chǔ)罐流量更大的輸液泵≥50ml定量管≥1ml進(jìn)樣泵≥50ml≥10mm法蘭柱DAC大體積流通池接溶劑回收系統(tǒng)制備系統(tǒng)第48頁,共69頁，2024年2月25日，星期天分析制備放大優(yōu)化分析方法的選擇性在分析柱上進(jìn)行超量載樣放大到制備柱設(shè)備的放大：過程第49頁,共69頁，2024年2月25日，星期天原料分析分析柱模擬制備放大至半制備（50DAC）中試放大（150or200DAC)工業(yè)化制備（300-800DAC)完全線性放大設(shè)備的放大：過程第50頁,共69頁，2024年2月25日，星期天可完全線性放大原因：可達(dá)到30000每米的塔板數(shù)，幾乎與10um填料的分析柱柱效相當(dāng)800DAC柱效測試結(jié)果圖設(shè)備的放大：過程第51頁,共69頁，2024年2月25日，星期天上樣量的調(diào)整：

mp/ma=lp/la*rp/raL:柱長；m：進(jìn)樣量；r：色譜柱內(nèi)徑p:制備柱；a：分析柱重點(diǎn)122設(shè)備的放大：公式第52頁,共69頁，2024年2月25日，星期天流速的調(diào)整：Fp/Fa=Vp/Va=Lp/La*rp/raF

：流速

；V:柱體積；L:柱長；r：色譜柱內(nèi)徑；p:制備柱；a：分析柱重點(diǎn)222設(shè)備的放大：公式第53頁,共69頁，2024年2月25日，星期天梯度的調(diào)整方法：tp/ta=Vp/Va*Fp/FaF

：流速

；V:柱體積；t:梯度洗脫時(shí)間；p:制備柱；a：分析柱重點(diǎn)3設(shè)備的放大：公式第54頁,共69頁，2024年2月25日，星期天example樣品：粗品含量大約68%，白色粉末狀固體，對熱（能夠耐受100攝氏度）和光穩(wěn)定客戶要求：純化后純度大于99%，單雜小于0.8%，回收率達(dá)到70%1step:了解客戶需求從分析到制備的過程：案例第55頁,共69頁，2024年2月25日，星期天2step:原始樣品分析example用分析型HPLC（填料5u甚至更小）對樣品進(jìn)行分離，并對流動(dòng)相進(jìn)行改進(jìn)，直到主峰和雜質(zhì)完全分離，摸索好的條件用來對以后純化后的樣品進(jìn)行純度分析。從分析到制備的過程：案例第56頁,共69頁，2024年2月25日，星期天example分析條件：甲醇：乙腈：水=81：12：7檢測波長：246nm流速：1.0mL/min柱子：C18，5μm，4.6*250mm結(jié)果從分析到制備的過程：案例第57頁,共69頁，2024年2月25日，星期天3step:分析柱模擬制備填料粒徑≥10um，4.6*250mm的柱子不加非揮發(fā)性的酸堿鹽，重新摸索制備條件主峰和雜質(zhì)分離充分的條件下開始做過載實(shí)驗(yàn)將主峰分段收集，一般為分成10段左右分別測定純度，計(jì)算回收率，進(jìn)一步優(yōu)化制備條件從分析到制備的過程：案例第58頁,共69頁，2024年2月25日，星期天example制備條件摸索流動(dòng)相填料90%甲醇、75%甲醇、75%乙腈、70%乙腈、60%乙腈。4種不同品牌的填料60%乙腈XX牌填料C18-10um-100A確定確定從分析到制備的過程：案例第59頁,共69頁，2024年2月25日，星期天example分析柱模擬制備譜圖結(jié)果從分析到制備的過程：案例第60頁,共69頁，2024年2月25日，星期天4step:確定最大上樣量不斷增大上樣量，直到回收率明顯下降理論上樣量：填料質(zhì)量的3‰---8‰，可以從3‰逐漸增大來確定最大上樣量第61頁,共69頁，2024年2月25日，星期天example60%乙腈，進(jìn)樣量4‰時(shí)，收率為36.3%60%乙腈，進(jìn)樣量3‰時(shí)，收率為78.9%選擇上樣量為3‰從分析到制備的過程：案例第62頁,共69頁，2024年2月25日，星期天最終確定的制備條件：流動(dòng)相：60%乙腈-水上樣量：填料質(zhì)量的3‰填料：XX牌-C8-10um-100A樣品溶劑：流動(dòng)相從分析到制備的過程：案例第63頁,共69頁，2024年2月25日，星期天5step:放大分析柱模