P2X7嘌呤受體在肥大細胞依賴性結腸炎中的作用及機制研究

P2X7嘌呤受體在肥大細胞依賴性結腸炎中的作用及機制研究研究背景炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease,IBD)是一類病因和發(fā)病機制不詳的慢性難治性腸道炎性疾病,分為潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis,UC)和克羅恩病(Crohn’sdisease,CD)兩型。資料顯示,P2X7嘌呤受體與炎癥密切相關,且在腸道細胞廣泛表達,近年來其在IBD的研究中日益受到重視。肥大細胞(mastcell,MC)是介導炎癥反應及速發(fā)型變態(tài)反應的重要樞紐,CD患者中表達P2X7嘌呤受體的MC顯著增加。此外,研究顯示,神經酰胺-CD300f結合通過抑制IgE依賴性和MC依賴性過敏反應。然而,CD300f在MC介導的結腸炎中的作用還不是很清楚。目前,關于P2X7嘌呤受體介導的MC的激活對IBD的作用機制研究仍在進展中,不能確定機體如何調控P2X7嘌呤受體,以及P2X7嘌呤受體與MC表面CD300f的相互作用關系,需要進一步探究。目的本實驗用葡聚糖硫酸鈉(dextransulfatesodium,DSS)構建IBD模型,通過給予神經酰胺和多球殼菌素分別激活和抑制CD300f,評估小鼠疾病活動度和結腸形態(tài)學與組織學變化情況,檢測小鼠結腸組織中P2X7嘌呤受體、MC和CD300f的表達水平,檢測血清中類胰蛋白酶及組胺的表達情況,檢測P2X7嘌呤受體與激活轉錄因子2(activatingtranscriptionfactor-2,ATF2)的共定位情況。探討P2X7嘌呤受體在MC依賴性結腸炎中的部分作用機制,為IBD的治療提供新的思路和方法。方法1.模型的建立:SPF級雄性BALB/c小鼠,6-8周,給予2.75%DSS自由飲用7天。2.實驗動物分組:將48只雄性BALB/c小鼠隨機分為4組,12只/組。陰性對照組:自由飲用高壓滅菌水7天。DSS模型組:自由飲用2.75%DSS溶液7天。DSS+神經酰胺組:除給予2.75%DSS自由飲用外,于第2天和第6天分別腹腔注射100μg神經酰胺。DSS+多球殼菌素組:除給予2.75%DSS自由飲用外,于第2天腹腔注射5μg多球殼菌素。3.每日監(jiān)測小鼠體質量變化、大便性狀及是否大便帶血、飲水量及飲食量,于第8天采用眼球摘除放血法將所有小鼠處死,收集血清及結腸組織,同時測量結腸長度。4.依據小鼠體質量變化和糞便情況進行疾病活動度(diseaseactivityindex,DAI)評分,取小鼠結腸組織行HE染色評估結腸炎嚴重程度。采用免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)和Western-Blot法檢測P2X7嘌呤受體、MC和CD300f的表達情況。采取酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測小鼠血清中類胰蛋白酶和組胺的表達水平。用免疫熒光法(immunofluorescence,IF)觀察結腸組織P2X7嘌呤受體與ATF2的共定位情況。5.利用SPSS21.0軟件分析處理數據,計量資料用均數±標準差(?x±s)表示。經方差齊性分析及正態(tài)性檢驗后,多組定量資料之間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA),兩兩之間比較用t檢驗,檢驗水準α=0.05,P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.DAI評分與陰性對照組相比,DSS模型組小鼠明顯出現(xiàn)體質量下降、稀便、肉眼血便。DSS+Ceramide組較DSS模型組癥狀較輕,DSS+Myriocin組較DSS模型組癥狀稍重。四組DAI評分:DSS模型組高于陰性對照組(P<0.05),DSS+Ceramide組低于DSS模型組(P<0.05),DSS+Myriocin組稍高于DSS模型組(P>0.05)。2.結腸長度與陰性對照組相比,DSS模型組和DSS+Myriocin組小鼠結腸長度縮短,腸腔內大便不成形,散在分布血性內容物,腸黏膜不同程度充血水腫,DSS+Ceramide組小鼠結腸外觀大體和陰性對照組相同。四組結腸長度:DSS模型組小于陰性對照組(P<0.05),DSS+Ceramide組大于DSS模型組(P<0.05),DSS+Myriocin組小于DSS模型組(P>0.05)。3.組織學評分與陰性對照組相比,DSS模型組和DSS+Myriocin組小鼠結腸上皮細胞及固有層腺體結構不同程度破壞,隱窩融合、變形、消失,黏膜層及黏膜下層可見大量炎性細胞浸潤,DSS+Ceramide組鏡下表現(xiàn)較輕。四組組織學評分:DSS模型組高于陰性對照組(P<0.05),DSS+Ceramide組低于DSS模型組(P<0.05),DSS+Myriocin組稍高于DSS模型組(P>0.05)。4.免疫組織化學法檢測結腸組織P2X7、MC、CD300f的表達四組結腸中P2X7、MC、CD300f的表達:DSS模型組高于陰性對照組(P<0.05),DSS+Ceramide組P2X7、MC的表達低于DSS模型組(P<0.05),CD300f的表達高于DSS模型組(P<0.05),DSS+Myriocin組稍高于DSS模型組(P>0.05)。5.WesternBlot法檢測結腸組織P2X7、MC、CD300f的表達四組結腸中P2X7的表達:DSS模型組稍高于陰性對照組(P>0.05),DSS+Ceramide組低于DSS模型組(P<0.05),DSS+Myriocin組稍高于DSS模型組(P>0.05)。四組結腸中MC的表達:DSS模型組稍高于陰性對照組(P>0.05),DSS+Ceramide組低于DSS模型組(P<0.05),DSS+Myriocin組稍高于DSS模型組(P>0.05)。四組結腸中CD300f的表達:DSS模型組高于陰性對照組(P<0.05),DSS+Ceramide組高于DSS模型組(P<0.05),DSS+Myriocin組稍低于DSS模型組(P>0.05)。6.ELISA法檢測小鼠血清中類胰蛋白酶、組胺的含量四組血清中類胰蛋白酶的含量:DSS模型組大于陰性對照組(P<0.05),DSS+Ceramide組小于DSS模型組(P<0.05),DSS+Myriocin組大于DSS模型組(P<0.05)。四組血清中組胺的含量:DSS模型組稍大于陰性對照組(P>0.05),DSS+Ceramide組小于DSS模型組(P>0.05),DSS+Myriocin組稍大于DSS模型組(P>0.05)。7.免疫熒光法