遺傳工程動物模型

關(guān)于遺傳工程動物模型第一節(jié)概述

人們經(jīng)過了長期不懈的努力，渴望揭開生命之謎，雖有進展，但謎仍然是謎。然而，隨著2001年6月人類基因組草圖公布，生命科學也隨著進入到一個新的紀元－后基因組時代，即由結(jié)構(gòu)基因組轉(zhuǎn)向功能基因組的研究，大規(guī)模、系統(tǒng)地研究基因功能及其在生理和病理過程中的作用。因此，遺傳工程動物模型是必不可少的研究工具。第2頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一、定義

運用各種技術(shù)手段有目的地干預(yù)動物的遺傳組成，導致動物新的性狀的出現(xiàn)，并使其能有效地遺傳下去，形成新的可供生命科學研究和其他目的所用的動物模型，這類動物可被稱為遺傳工程動物模型。第3頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、技術(shù)手段

顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)

基因定位突變技術(shù)

化學或放射誘變技術(shù)第4頁,共54頁，2024年2月25日，星期天顯微注射法胚胎干細胞法

(embryonicstemcells，ES細胞)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法細胞核移植ENU誘變?nèi)?、基本方法?頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動物Gordon等人首次成功地將含有HSV和SV40DNA片段的重組質(zhì)粒DNA以顯微注射法導入小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，得到了帶有這種外源DNA順序TGM。1982年P(guān)almiter等運用此法得到的所謂“超級巨鼠”,曾引起整個生物學界的轟動。第6頁,共54頁，2024年2月25日，星期天到目前為止，人類已獲得轉(zhuǎn)基因魚、鼠、羊、豬、兔、牛等等大小動物。從轉(zhuǎn)基因動物所獲得的資料幾乎涉及醫(yī)學遺傳、腫瘤學、免疫學等的基因研究，還涉及生物藥物的研究，基因治療的開發(fā)研究等。第7頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

一、概念

通過實驗手段將外源遺傳物質(zhì)導入到動物生殖細胞中，并能穩(wěn)定遺傳，由此獲得的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物。

遺傳改變：外源DNA的插入使基因組中任何一個基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排；導入可以持久存在的遺傳實體。第8頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

二、基本原理目的基因：顯微注射受精卵或胚胎細胞整合植入輸卵管外源基因：順式作用元件結(jié)構(gòu)基因報告基因(reportgene)融合基因第9頁,共54頁，2024年2月25日，星期天顯微注射法胚胎干細胞法

(embryonicstemcells，ES細胞)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法細胞核移植三、基本方法第10頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

以單細胞受精卵為靶細胞，利用顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好的載體DNA直接注射入受精卵的原核，再將接受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續(xù)發(fā)育獲得轉(zhuǎn)基因動物個體。

目前應(yīng)用較廣泛，最早最經(jīng)典的方法。（一）雄原核顯微注射法第11頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1.程序準備假孕母鼠受精卵的準備基因?qū)肱咛ヒ浦矊τ资蟮蔫b定第12頁,共54頁，2024年2月25日，星期天PMSG第13頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共54頁，2024年2月25日，星期天外源DNA大小基本不受限制（1～50kb）；導入過程直觀；整合率高2.優(yōu)點：第21頁,共54頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備昂貴、環(huán)節(jié)較多對操作人員有較高的技術(shù)要求低效率（尤其是大家畜）對卵子傷害大，胚胎存活率低基因整合隨機性轉(zhuǎn)基因沉默3.缺點：第22頁,共54頁，2024年2月25日，星期天基因特異表達的研究發(fā)現(xiàn)基因的新功能發(fā)現(xiàn)新基因建立基因表達、調(diào)控的動物模型建立人類疾病的動物模型等4.應(yīng)用第23頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（二）胚胎干細胞（ES）法ES細胞是早期胚胎的內(nèi)細胞團經(jīng)過體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細胞系。將攜帶有外源基因的ES細胞注入到動物的早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體及轉(zhuǎn)基因動物。它本身是二倍體，能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能性，可以形成包括生殖細胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。第26頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

在ES細胞上的基因操作：可以通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、脂質(zhì)體介導、電穿孔、磷酸鈣共沉淀等方法將外源基因?qū)隕S細胞。因此，借用ES細胞系可將人們企望的某種不完整的、無功能基因直接引入到ES細胞中，通過細胞增殖、篩選可得到喪失了某種基因功能的動物后代。第27頁,共54頁，2024年2月25日，星期天胚胎干細胞(ES細胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性外源目的基因打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標志HSV-tk陰性篩選標志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)1.必備條件第28頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共54頁，2024年2月25日，星期天打靶載體的構(gòu)建打靶載體導入ES細胞：重組置換基因敲除ES細胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種2.基本程序第32頁,共54頁，2024年2月25日，星期天InjectionofES

cellsintoblastocysts第33頁,共54頁，2024年2月25日，星期天外源基因整合情況的可控性高?？深A(yù)先在細胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因?qū)隕S細胞的方法多樣，細胞鑒定及篩選方便。3.優(yōu)點第34頁,共54頁，2024年2月25日，星期天ES細胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細胞的未分化及多向分化潛能不易所得個體為嵌合體目前，胚胎干細胞介導法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動物上應(yīng)用較晚。4.缺點第35頁,共54頁，2024年2月25日，星期天遺傳病研究腫瘤的研究生物制藥5.在醫(yī)學中的應(yīng)用第36頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（三）反轉(zhuǎn)錄病毒法（四）精子載體法第37頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共54頁，2024年2月25日，星期天細胞核移植法第39頁,共54頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)基因動物是在單細胞基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。而許多基因的表達是無法通過轉(zhuǎn)染的方法來研究；基因表達有時空與組織的特異性；外源基因的表達受特異性有關(guān)順式作用序列的調(diào)控；因此，只有通過轉(zhuǎn)基因的動物才有可能研究基因的表達、調(diào)控及基因之間的相互作用。四轉(zhuǎn)基因動物的意義第40頁,共54頁，2024年2月25日，星期天進行功能基因組學的研究，研究外源基因在動物整體水平的表現(xiàn)調(diào)控規(guī)律。轉(zhuǎn)基因動物疾病模型可用來進行疾病發(fā)病學和治療性研究。也可改變動物基因使其表現(xiàn)型更適合人類需要。還可以用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)一些人類所需的生物活性物質(zhì)。第41頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)ENU誘變小鼠ENU致突變技術(shù)是高通量大規(guī)模篩選新基因及發(fā)育突變技術(shù)的化學方法：當人們還不能獲得ES細胞時，小鼠遺傳學家最常用的方法是用乙烷基亞硝基脲（ENU)處理公鼠，然后在后代中篩選顯性或隱性突變的小鼠。隨著越來越多的基因和微衛(wèi)星標記被定位，突變基因的定位也隨之變得容易；因此對小鼠進行化學誘變將越來越變得低成本而高效益。第42頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一、ENU誘變的技術(shù)路線1.ENU誘變的簡單流程

ENU處理雄性C57BL/6小鼠，10周后與同品系母鼠配種，F(xiàn)l離乳時篩查，陽性突變小鼠留種，與同品系正常母鼠配種，F(xiàn)l有親代突變表型者留種(為顯性遺傳)，基因定位、培育新的模型、基因克隆、基因功能研究。隱性突變篩選需由Fl互交或F2回交Fl，發(fā)現(xiàn)突變表型者留種，進行進一步的研究。第43頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2．顯性突變的篩選

10周齡的雄性小鼠按150mg/kg體重的劑量腹腔注射ENU，60天后待處理公鼠恢復生殖能力后與野生型雌性配種，通過對F1代小鼠進行形態(tài)學、行為學、血液學、生理生化等指標的檢測，可篩選基因的顯性突變。

3．隱性突變的篩選基因隱性突變的篩選需將F1代的雄性鼠與野生型雌性小鼠交配，再將F1代雌性小鼠與F1代雄性鼠回交或F2代雌、雄鼠交配，獲得F3代小鼠，并將F3代小鼠用于大規(guī)模篩選。第44頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

4．基因驅(qū)動法與表型驅(qū)動法相結(jié)合的ENU誘變篩選單基因剔除是典型的基因驅(qū)動的研究。研究者必須針對靶位點在染色體組文庫中篩選相關(guān)的染色體組克隆，繪制相應(yīng)的物理圖譜，構(gòu)建特異性的打靶載體以及篩選中靶ES細胞等。通常一個基因剔除純合子小鼠的獲得需要1年或更長的時間。面對人類基因組計劃產(chǎn)生出來的巨大的功能未知的遺傳信息，傳統(tǒng)的基因剔除方法顯得力不從心，不符合現(xiàn)代生物學高通量、大規(guī)模篩選的要求。第45頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

用放射線導致缺失和突變以及用各種化學誘變劑誘導點突變等許多經(jīng)典的遺傳學研究屬于表型驅(qū)動的研究。早在20世紀90年代初，研究者就提出帶有第7號染色體缺失的小鼠可用來篩選ENU誘導的缺失區(qū)域內(nèi)的點突變?；虼虬械难芯窟M展使得研制攜帶染色體組任意片段的缺失、倒位或者易位突變小鼠成為可能。RamirezSolis應(yīng)用位點特異的重組酶系統(tǒng)首次在小鼠ES細胞中實現(xiàn)了最長3～4cM染色體組片段的缺失、倒位和重復。并采用同源重組技術(shù)構(gòu)建了大片段染色體缺失的基因剔除小鼠。第46頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

將基因打靶這種基因驅(qū)動的研究和ENU誘變這種表型驅(qū)動的研究結(jié)合起來具有明顯的優(yōu)勢。ENU誘變可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的突變體小鼠，但點突變的鑒定依然是費時費力的工作。采用通過基因打靶獲得的特定染色體組缺失或者易位的ES細胞建立突變小鼠可以簡化篩選的程序和工作量，并把點突變限定在序列已知的區(qū)域內(nèi)，這樣可以大大簡化點突變鑒定的過程。第47頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

5．ENU突變表型篩選

ENU誘導突變表型的篩選包括形態(tài)異常表型、行為和神經(jīng)功能異常、血液學和臨床生化指標和老年癥狀篩選等。形態(tài)異常表型的篩選通常在小鼠分窩時進行。行為和神經(jīng)功能異常篩選包括肌肉缺陷和運動神經(jīng)元低下、感官缺陷、精神、小腦平衡、自律行為方面的缺陷等。第48頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

有表型的小鼠將通過更復雜的測試，如探險運動、食物攝取、學習和記憶；焦慮、神經(jīng)心理學測試等等。血液學測試在小鼠6～10周時進行。隨機挑選無表型的小鼠飼養(yǎng)1年以上再進行老年癥狀表型篩選。主要觀察是否具有老年相關(guān)疾病的表型，包括體重增加、動脈硬化、骨質(zhì)疏松、心血管異常、感知功能和行為異常等等。第49頁,共54頁，2024年2月25日，星期天ENU誘變的最終目的是為了鑒定導致表型的突變基因，發(fā)現(xiàn)新的基因和新的代謝途徑，促進人類對哺乳類動物基因功能的了解。位置候選基因法是鑒定突變基因的首選方法：用50只突變回交小鼠做連鎖分析。突變大致可定位在10～20cM的范圍內(nèi)。分析500只回交小鼠可將突變定位在1cM的范圍內(nèi)。基因驅(qū)動法與表型驅(qū)動法相結(jié)合的ENU誘變篩選的小鼠，其突變已被定位在特定的染色體組區(qū)域內(nèi)，因而不用再作連鎖分析。二、ENU誘導點突變的鑒定第50頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

在突變基因被精確地定位后，結(jié)合突變小鼠的表型進行候選基因的預(yù)測。候選基因的線索可從多方面的分析獲得。比如小