膜片鉗技術(shù)及應(yīng)用

關(guān)于膜片鉗技術(shù)及應(yīng)用膜片鉗技術(shù)向細(xì)胞內(nèi)注射恒定或變化的電流刺激，紀(jì)錄由此引起的膜電位的變化，這叫做電流鉗技術(shù)。在具體實驗中，可通過給予細(xì)胞一系列電流脈沖刺激，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生動作電位。第2頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

電壓鉗技術(shù)是通過向細(xì)胞內(nèi)注射一定的電流，抵消離子通道開放時所產(chǎn)生的離子流，從而將細(xì)胞膜電位固定在某一數(shù)值。由于注射電流的大小與離子流的大小相等、方向相反。因此它可以反映離子流的大小和方向。第3頁,共31頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗技術(shù)膜片鉗技術(shù)與電流鉗、電壓鉗技術(shù)在命名上并不完全一致，后兩者是從電學(xué)概念的角度命名的，而“膜片鉗”主要是從機械物理學(xué)的角度命名的。第4頁,共31頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗技術(shù)從字面上理解，膜片鉗技術(shù)鉗制的是“膜片”，是指采用尖端經(jīng)處理的微電極與細(xì)胞膜發(fā)生緊密接觸，使尖端下的這片細(xì)胞膜在電學(xué)上與其他細(xì)胞膜分離，這大大降低了背景噪聲，使單通道微弱的電流得以分辨出來。第5頁,共31頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗技術(shù)所以，膜片鉗技術(shù)是一種通過微電極與細(xì)胞膜之間形成緊密接觸的方法，采用電壓鉗或電流鉗技術(shù)對生物膜上的離子通道的電活動進(jìn)行記錄的微電極技術(shù)。膜片鉗技術(shù)是一種特殊的電壓鉗/電流鉗技術(shù)。第6頁,共31頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗技術(shù)用特制的玻璃微吸管吸附于細(xì)胞表面，使之形成10～100GΩ的密封，被孤立的小膜片面積為μm2量級，內(nèi)中僅有少數(shù)離子通道。然后對該膜片實行電壓鉗位，可測量單個離子通道開放產(chǎn)生的pA量級的電流，這種通道開放是一種隨機過程。通過觀測單個通道開放和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布，并分析膜電位與離子濃度等之間的關(guān)系。第7頁,共31頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗實驗系統(tǒng)雖然可因研究目的不同而有所區(qū)別，但其基本組成是相同的，包括膜片鉗放大器和接口，顯微鏡和視頻監(jiān)視器以及防震臺和屏蔽罩等。第8頁,共31頁，2024年2月25日，星期天倒置顯微鏡、防震臺、屏蔽罩、三維操縱儀三維操縱儀倒置顯微鏡第9頁,共31頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗放大器第10頁,共31頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗實驗流程膜片鉗實驗方法包括：制備玻璃微電極；制備細(xì)胞標(biāo)本；建立高阻封接；電流記錄。第11頁,共31頁，2024年2月25日，星期天制備玻璃微電極拉制微電極材料：硼硅酸鹽毛細(xì)玻璃管。要求：玻璃毛胚外徑1.3~1.7㎜，內(nèi)徑1.0~1.2㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁越厚，拉制出的電極尖端管壁也越厚，電極的跨壁電容就越小，噪聲也就越低。第12頁,共31頁，2024年2月25日，星期天玻璃微電極及膜片的幾何形狀第13頁,共31頁，2024年2月25日，星期天電極拉制儀第14頁,共31頁，2024年2月25日，星期天拉制方法：兩步拉制法。第一步：使玻璃軟化，并拉開一個距離，形成一個細(xì)管，即拉制電極的頸部；第二步：使用較低的熱度，拉斷細(xì)管部，成為兩個基本相同的玻璃微電極，此步控制電極的尖端。一般拉制出的玻璃微電極尖端直徑為1~5μm。第15頁,共31頁，2024年2月25日，星期天涂膠和拋光對玻璃微電極進(jìn)行涂膠和拋光。涂膠（疏水性涂料，如硅酮樹脂）主要是為了減小電極的跨壁電容。第16頁,共31頁，2024年2月25日，星期天拋光儀拋光是指將玻璃微電極靠近加熱的鉑絲，從而使電極尖端變光滑的過程。拋光主要目的是。防止電極尖端刺破細(xì)胞，利于高阻封接。第17頁,共31頁，2024年2月25日，星期天電極液的充灌對于尖端較細(xì)的玻璃微電極，膜片鉗實驗中常用的方法是：在微電極尾部施加負(fù)壓使尖端充灌電極內(nèi)液，然后用注射器在微電極尾部充灌電極內(nèi)液，最后輕彈微電極桿步使其內(nèi)的氣泡排出。充灌長度為電極的1/3。第18頁,共31頁，2024年2月25日，星期天制備細(xì)胞標(biāo)本從理論上來講，膜片鉗實驗用的細(xì)胞標(biāo)本可來自體內(nèi)各種組織細(xì)胞，只要細(xì)胞表面光滑，能與微電極尖端形成高阻封接即可。但在標(biāo)本制備上，不同組織細(xì)胞間聯(lián)接牢固程度不同，采用的分離方法也不完全相同。大體上包括沖洗、酶解消化或機械分離以及清洗等步驟。第19頁,共31頁，2024年2月25日，星期天建立高阻封接在顯微鏡下找到微電極，移動三維操縱儀，使電極尖端接觸細(xì)胞，形成高阻封接。第20頁,共31頁，2024年2月25日，星期天建立高阻封接高阻封接形成是進(jìn)行膜片鉗實驗的關(guān)鍵一步。微電極尖端與細(xì)胞膜形成封接的過程，可以采用軟件發(fā)出1mV脈沖電壓作用于微電極，造成膜兩側(cè)電位差發(fā)生變化，產(chǎn)生電極電流，再通過顯示屏，觀察電極電流幅度的變化來確定封接程度。在電極未入溶液之前，在顯示器上可見一直線。第21頁,共31頁，2024年2月25日，星期天高阻封接形成的電流圖第22頁,共31頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗技術(shù)四種基本記錄模式細(xì)胞吸附膜片(cell-attached

patch)將兩次拉制后經(jīng)加熱拋光的微管電極置于清潔的細(xì)胞膜表面上，形成高阻封接，在細(xì)胞膜表面隔離出一小片膜，既而通過微管電極對膜片進(jìn)行電壓鉗制，高分辨測量膜電流，稱為細(xì)胞貼附膜片。由于不破壞細(xì)胞的完整性，第23頁,共31頁，2024年2月25日，星期天全細(xì)胞記錄法(Whole-cell

recording)

在高阻抗封接做好后，再給一個很小的負(fù)壓，將電極覆蓋的膜吸破，使電極內(nèi)與整個細(xì)胞內(nèi)相通，用這個方法可記錄進(jìn)出整個細(xì)胞的電流。第24頁,共31頁，2024年2月25日，星期天內(nèi)面向外膜片(inside-out

patch)高阻封接形成后，在將微管電極輕輕提起，使其與細(xì)胞分離，電極端形成密封小泡，在空氣中短暫暴露幾秒鐘后，小泡破裂再回到溶液中就得到“內(nèi)面向外”膜片。第25頁,共31頁，2024年2月25日，星期天外面向外膜片（Outside-outpatch）在全胞記錄式的基礎(chǔ)上，拉開電極使之與胞體脫離，這是附在電極尖端的膜片又可自動地將電極尖端口封住。此膜片的外側(cè)面向外其是在全細(xì)胞記錄的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成。第26頁,共31頁，2024年2月25日，星期天膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用2008年，第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物物理研究所的研究人員采用膜片鉗和激光掃描共聚焦顯微鏡，同步實時系統(tǒng)觀察心肌細(xì)胞鈣離子的釋放。第27頁,共31頁，2024年2月25日，星期天基本原理膜片鉗能獲得膜上鈣離子通道的離子電流，但不能對離子的移動進(jìn)行實時定位，

不能定量分析離子濃度。激光掃描共聚焦顯微鏡可以對鈣離子的移動進(jìn)行實時定位,但無法對單個離子通道的離子移動信號(如單通道電流)進(jìn)行分析。第28頁,共31頁，2024年2月25日，星期天大鼠心室肌細(xì)胞L2型鈣通道電流(ICa,L)第29頁,共31頁，2024年2月25日，星期天采用膜片鉗-激光掃描共聚焦顯微鏡同步實