含有天然多酚修飾的多肽自組裝分子合成與制備分析研究 功能材料學(xué)專業(yè)

目錄摘要 1Abstract 2內(nèi)容提要 3第一章設(shè)計(jì)選題及構(gòu)思 4第二章背景資料 52.1多肽分子自組裝 62.3多肽水凝膠 102.2沒食子酸和咖啡酸 13第三章設(shè)計(jì)目標(biāo)及可行性分析 14第四章多肽的合成及修飾 154.1實(shí)驗(yàn)材料 154.1.1實(shí)驗(yàn)試劑： 154.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 164.2實(shí)驗(yàn)步驟 174.2.1NapFFKYp的合成和純化 174.2.3NapFFK(GA)Yp的合成 184.2.4NapFFK(CA)Yp的合成 194.3產(chǎn)物分子的化學(xué)分析與測(cè)試 204.3.1質(zhì)譜 204.3.2核磁共振氫譜（1HNMR）表征 214.3.3核磁共振磷譜（31PNMR）表征 23第五章多肽分子自組裝形成的水凝膠的性能研究 255.1實(shí)驗(yàn)材料 255.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 255.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 255.2實(shí)驗(yàn)步驟 255.2.1水凝膠的制備 255.2.2TEM制樣 265.2.3SEM制樣 265.2.4流變測(cè)試 275.3物理表征結(jié)果及分析 275.3.1TEM表征多肽自組裝的微觀形貌 275.3.2SEM表征水凝膠的多孔性形貌 275.3.3流變儀表征水凝膠的力學(xué)性能 28結(jié)論 30參考文獻(xiàn) 31致謝 33摘要近幾年來多肽成為制備超分子水凝膠的一種高效凝膠因子。多肽具有良好的生物相容性和可控的生物降解性能,除此之外，多肽側(cè)鏈可能還含有氨基、羧基和羥基等官能團(tuán)，易被其它生物功能分子修飾。本論文主要研究了含天然多酚沒食子酸和咖啡酸修飾的多肽自組裝分子NapFFK(GA)Yp和NapFFK(CA)Yp的制備和表征。我們研究發(fā)現(xiàn)，在pH=7.4時(shí)，NapFFK(GA)Yp和NapFFK(CA)Yp兩種分子都可以在堿性磷酸酶（ALP）的作用下自組裝形成具有納米纖維結(jié)構(gòu)的超分子水凝膠。關(guān)鍵詞：超分子水凝膠，多肽自組裝，咖啡酸，沒食子酸

AbstractPeptidescanworkaseffectivehydrogelatorstopreparesupramolecularhydrogelsinrecentyears,becauseoftheirgoodbiocompatibilityandcontrollablebiodegradability.Inaddition,theirsidechainsmaycontainmanyfunctionalgroupssuchas,carboxylicacid,aminoandhydroxylgroups,sotheyareeasytobemodifiedwithotherbiofunctionalmoieties.ThisdissertationmainlystudiesthepreparationandcharacterizationofNapFFK(GA)YpandNapFFK(CA)Yp,whichcontaindifferentnaturalpolyphenolmoieties(e.g.,gallicacidandcaffeicacid).Wefoundthatthesetwomolecules(e.g.,NapFFK(GA)YpandNapFFK(CA)Yp)canself-assembletoformnanofiberstructuresandsupramolecularhydrogelstriggeredbyalkalinephosphatase(ALP)atpH7.4.Keywords:supramolecularhydrogel,peptideself-assembly,caffeicacid,gallicacid.

內(nèi)容提要本文擬在多肽分子NapFFKYp上修飾沒食子酸（GA）和咖啡酸（CA）合成兩種新型的多肽自組裝分子NapFFK(GA)Yp和NapFFK(CA)Yp。本文第一章介紹了本設(shè)計(jì)的選題及構(gòu)思；第二章介紹了多肽自組裝、多肽水凝膠、沒食子酸和咖啡酸的研究現(xiàn)狀；第三章分析了本課題實(shí)施的可行性；第四章通過固相合成法合成多肽分子NapFFKYp，然后在NapFFKYp上修飾GA和CA進(jìn)一步合成NapFF(GA)Yp和NapFF(CA)Yp，最后對(duì)產(chǎn)物分子進(jìn)行化學(xué)測(cè)試（質(zhì)譜、核磁氫譜、核磁磷譜），確定產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；第五章通過掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）和流變儀探究NapFF(GA)Yp和NapFF(CA)Yp分子的自組裝性能。

第一章設(shè)計(jì)選題及構(gòu)思多肽分子NapFFKYp（結(jié)構(gòu)式見1-1）是已經(jīng)被證實(shí)的一種良好的酶響應(yīng)型凝膠因子。Xu等人[[]ZhangY,KuangY,GaoY,etal.Versatilesmall-moleculemotifsforself-assemblyinwaterandtheformationofbiofunctionalsupramolecularhydrogels.[J].LangmuirtheAcsJournalofSurfaces&Colloids,2011,27(2):529.,[]YangZ,XuB.Asimplevisualassaybasedonsmallmoleculehydrogelsfordetectinginhibitorsofenzymes[J].ChemicalCommunications,2004,10(21):2424-2425.]發(fā)現(xiàn)NapFF可以作為凝膠因子的骨架，其含有萘基和兩個(gè)苯丙氨酸殘基，可以在低濃度下可以通過萘環(huán)和苯環(huán)的π-π堆積作用以及酰胺鍵上的氫鍵作用實(shí)現(xiàn)自組裝。而Yp使NapFFKYp具有自組裝可控的特點(diǎn)，可以用堿性磷酸酶(ALP)[]ZhangY,KuangY,GaoY,etal.Versatilesmall-moleculemotifsforself-assemblyinwaterandtheformationofbiofunctionalsupramolecularhydrogels.[J].LangmuirtheAcsJournalofSurfaces&Colloids,2011,27(2):529.[]YangZ,XuB.Asimplevisualassaybasedonsmallmoleculehydrogelsfordetectinginhibitorsofenzymes[J].ChemicalCommunications,2004,10(21):2424-2425.圖1-1NapFFKYp的結(jié)構(gòu)式NapFFKYp上的賴氨酸側(cè)鏈上存在一個(gè)氨基殘基，故此多肽分子可被其它生物功能分子修飾。而沒食子酸（GA）和咖啡酸（CA）（結(jié)構(gòu)式見第二章）具有良好的抗腫瘤和抗氧化性能，并且二者都含有羧基，可以與NapFFKYp側(cè)鏈上的氨基反應(yīng)，形成酰胺鍵。綜上，本課題擬在多肽分子NapFFKYp上修飾GA和CA，設(shè)計(jì)合成兩種新型凝膠因子NapFFK(GA)Yp（結(jié)構(gòu)式見圖1-2）和NapFFK(CA)Yp（結(jié)構(gòu)式見圖1-3）。并探究這兩種分子的自組裝性能。圖1-2：NapFFK(GA)Yp結(jié)構(gòu)式圖1-3：NapFFK(CA)Yp結(jié)構(gòu)式

第二章背景資料2.1多肽分子自組裝多肽是氨基酸的衍生物。多肽分子可以通過肽鍵間的氫鍵作用以及氨基酸殘基之間的疏水性作用、π-π堆積作用、靜電作用等[[]EstroffLA,HamiltonAD.Watergelationbysmallorganicmolecules.ChemRev,2004,104:1201–1217][]EstroffLA,HamiltonAD.Watergelationbysmallorganicmolecules.ChemRev,2004,104:1201–1217如果多肽在不受外界條件影響下能夠自發(fā)的形成超分子結(jié)構(gòu)，我們稱之為自發(fā)型自組裝，如Karin等人[[]KornmuellerK,LehoferB,MeindlC,etal.PeptidesattheInterface:Self-AssemblyofAmphiphilicDesignerPeptidesandTheirMembraneInteractionPropensity[J].Biomacromolecules,2016,17(11):3591-3601.]設(shè)計(jì)合成了一種短陰離子肽A[]KornmuellerK,LehoferB,MeindlC,etal.PeptidesattheInterface:Self-AssemblyofAmphiphilicDesignerPeptidesandTheirMembraneInteractionPropensity[J].Biomacromolecules,2016,17(11):3591-3601.圖2-1短陰離子肽A6YD的結(jié)構(gòu)式和自組裝體的TEM圖但是如果多肽必須在外界因素（常見的因素有溫度、pH、酶等）作用下，才能發(fā)生自組裝，則我們稱之為觸發(fā)型自組裝[[]許小丁,陳昌盛,陳荊曉,等.多肽分子自組裝[J].中國科學(xué):化學(xué),2011,41(2):221-238.]。觸發(fā)型自組裝肽由于具有很好的環(huán)境響應(yīng)性而可以在特定的位置和時(shí)間發(fā)生自組裝，并且具有可逆性，可以在一定條件下破壞自組裝體，因此更富有[]許小丁,陳昌盛,陳荊曉,等.多肽分子自組裝[J].中國科學(xué):化學(xué),2011,41(2):221-238.pH通常是通過改變多肽所帶的凈電荷來調(diào)控多肽自組裝行為的，凈電荷越小，分子間的靜電斥力也越小，越容易發(fā)生自組裝?？灯G晶等人[[]康艷晶,周希蕊,羅施中.pH響應(yīng)性雙親性多肽水凝膠pal-RLRRLRARARA的合成及表征[J].中國科技論文,2012(6):437-441.]設(shè)計(jì)合成了pal-RLRRLRARARA，發(fā)現(xiàn)[]康艷晶,周希蕊,羅施中.pH響應(yīng)性雙親性多肽水凝膠pal-RLRRLRARARA的合成及表征[J].中國科技論文,2012(6):437-441.圖2-2不同的pH對(duì)p-RRL分子自組裝的影響Rughani等人發(fā)現(xiàn)MLD多肽分子在不同的溫度下，自組裝行為不同。由圖2-3可知，在較低的溫度下MLD是未折疊的，當(dāng)15℃時(shí)，才出現(xiàn)了β-折疊，證明這時(shí)MLD才發(fā)生自組裝。

圖2-3pH=7.4時(shí)，濃度為150mM的多肽溶液在波長為218nm時(shí)測(cè)定的CD光譜隨溫度的變化。Ulijn[[]ToledanoS,WilliamsRJ,JayawarnaV,etal.Enzyme-triggeredself-assemblyofpeptidehydrogelsviareversedhydrolysis[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2006,128(4):1070-1071.]通過蛋白酶將Fmoc氨基酸與二肽偶聯(lián)以形成三肽，其可以通過芴基之間的π-π堆積作用自組裝成超分子結(jié)構(gòu)，如圖2-4所示。[]ToledanoS,WilliamsRJ,JayawarnaV,etal.Enzyme-triggeredself-assemblyofpeptidehydrogelsviareversedhydrolysis[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2006,128(4):1070-1071.圖2-4（A）實(shí)驗(yàn)反應(yīng)機(jī)制圖，（B）各種分子的結(jié)構(gòu)式上述兩種多肽都是基于多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)或者多肽分子的兩親性。多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由氨基酸通過肽鍵連接而成的鏈狀平面結(jié)構(gòu)。當(dāng)多肽溶于溶劑中時(shí)，多肽可以通過這些作用力從一級(jí)結(jié)構(gòu)向二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋，β-折疊，β-發(fā)夾）轉(zhuǎn)變，這種構(gòu)象的變化會(huì)導(dǎo)致多肽發(fā)生自組裝。Lego肽是一種典型的例子。它由極性和非極性氨基酸交替排列而成，可以通過形成β-折疊發(fā)生自組裝。RADA16-I肽[[]YokoiH,KinoshitaT,ZhangS.DynamicreassemblyofpeptideRADA16nanofiberscaffold.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2005,102(24):8414-8419.[]YokoiH,KinoshitaT,ZhangS.DynamicreassemblyofpeptideRADA16nanofiberscaffold.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2005,102(24):8414-8419.圖2-5RADA16-I肽的結(jié)構(gòu)以及自組裝形成的納米纖維基于分子的兩親性發(fā)生的自組裝的例子很多，上述文中提到的Ulijn和徐兵等人合成的多肽都是兩親性多肽分子，這種分子一般較短，通常以烷基鏈或芳香族基團(tuán)為端基，這類分子可以通過烷基的疏水性或芳香環(huán)的π-π堆積作用和多肽酰胺鍵之間的氫鍵共同作用發(fā)生自組裝?，F(xiàn)在很多人都選用Fmoc基團(tuán)作為芳香族基團(tuán)引入多肽序列實(shí)現(xiàn)自組裝。但研究表明，很多其它芳香族基團(tuán)也可以提供π-π堆積作用，如萘乙酸[[]YangZ,LiangG,MaM,etal.D-glucosamine-basedsupramolecularhydrogelstoimprovewoundhealing[J].ChemicalCommunications,2007,8(8):843-845.]、芘丁酸[[]ZhangY,YangZ,YuanF,etal.Molecularrecognitionremoldstheself-assemblyofhydrogelatorsandincreasestheelasticityofthehydrogelby10(6)-fold.[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2004,126(46):15028-15029.]等相繼被引入多肽序列中，實(shí)現(xiàn)了多肽的自組裝。徐兵等人[[]YangZ,LiangG,MaM,etal.D-glucosamine-basedsupramolecularhydrogelstoimprovewoundhealing[J].ChemicalCommunications,2007,8(8):843-845.[]ZhangY,YangZ,YuanF,etal.Molecularrecognitionremoldstheself-assemblyofhydrogelatorsandincreasestheelasticityofthehydrogelby10(6)-fold.[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2004,126(46):15028-15029.[]ZhangY,KuangY,GaoY,etal.Versatilesmall-moleculemotifsforself-assemblyinwaterandtheformationofbiofunctionalsupramolecularhydrogels.[J].LangmuirtheAcsJournalofSurfaces&Colloids,2011,27(2):529.圖2-6基于NapFF的多肽自組裝分子2.3多肽水凝膠當(dāng)多肽分子發(fā)生自組裝時(shí)，不僅在微觀上能形成納米纖維等聚集體，而且在宏觀上可以觀察到溶液到凝膠的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。凝膠是由凝膠因子形成的具有彈性的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和溶劑分子共同組成的粘彈性固體。水凝膠是以水作為溶劑的凝膠，制備水凝膠的原料主要是多糖、蛋白質(zhì)等天然生物材料和合成高分子。雖然聚合物水凝膠現(xiàn)在應(yīng)用廣泛，但是作為組織工程支架材料，聚合物水凝膠的微觀孔徑尺寸無法滿足細(xì)胞生長所需要的微觀環(huán)境，而且聚合物水凝膠生物相容性差，難降解。小分子多肽水凝膠除了生物相容性好和易降解外，還具有良好的溶脹性、粘彈性和環(huán)境響應(yīng)性，近幾年來引起了許多研究人員的關(guān)注。多肽水凝膠可以分為化學(xué)交聯(lián)的水凝膠和物理交聯(lián)的水凝膠，化學(xué)交聯(lián)的水凝和物理水凝膠的區(qū)別主要是形成水凝膠時(shí)分子間作用力的不同，前者是依靠的是化學(xué)鍵等化學(xué)作用力，凝膠過程不可逆。而后者是通過氫鍵、疏水作用和靜電作用力等物理作用交聯(lián)得到的，凝膠過程可逆；物理水凝膠形成的主要方式就是多肽分子的自組裝。19世紀(jì)90年代，張曙光等人發(fā)現(xiàn)多肽EAK16[[]ZhangS,

HolmesT,

LockshinC,

RichA.

Spontaneous

assemblyofa

self-complementaryoligopeptidetoformastablemacroscopicmembrane.

ProcNatlAcadSciUSA

1993;90:3334–8.]能夠形成β-折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，[]ZhangS,

HolmesT,

LockshinC,

RichA.

Spontaneous

assemblyofa

self-complementaryoligopeptidetoformastablemacroscopicmembrane.

ProcNatlAcadSciUSA

1993;90:3334–8.LuoY等人[[]LuoY,ShoichetMS.Aphotolabilehydrogelforguidedthree-dimensionalcellgrowthandmigration[J].NatureMaterials,2004,3(4):249.]旨在三維水凝膠基質(zhì)中建立生物化學(xué)通道以引導(dǎo)軸突生長，并由此設(shè)計(jì)合成了多肽分子GRGDS。這種將生物分子固定在三維基質(zhì)中的方法通?？梢詰?yīng)用于所有光學(xué)透明的水凝膠，在組織工程[]LuoY,ShoichetMS.Aphotolabilehydrogelforguidedthree-dimensionalcellgrowthandmigration[J].NatureMaterials,2004,3(4):249.圖2-7GRGDS的設(shè)計(jì)合成圖抗氧化劑Mito-2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧自由基（TEMPO）（MT）已經(jīng)被證實(shí)可以有效治療急性腎損傷（AKI），但其效率受限于短暫的半衰期和副作用。MengZhao等人旨在開發(fā)一種基于自組裝肽（SAP）的載體來減緩MT的釋放，從而增強(qiáng)其對(duì)AKI的長期治療效果。他們?cè)贙LD中插入天冬氨酸，設(shè)計(jì)合成了KLDD（圖2-8）。結(jié)果表明，KLDD可以自組裝成具有交聯(lián)納米纖維結(jié)構(gòu)水凝膠，并且用KLDD作為載體，MT的釋放速率較低，而且進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，注射SAP-MT的小鼠線粒體活性較高，副作用較小[[]ZhaoM,ZhouY,LiuS,etal.Controlreleaseofmitochondria-targetedantioxidantbyinjectableself-assemblingpeptidehydrogelamelioratedpersistentmitochondrialdysfunctionandinflammationafteracutekidneyinjury[J].DrugDelivery,2018:546-554.][]ZhaoM,ZhouY,LiuS,etal.Controlreleaseofmitochondria-targetedantioxidantbyinjectableself-assemblingpeptidehydrogelamelioratedpersistentmitochondrialdysfunctionandinflammationafteracutekidneyinjury[J].DrugDelivery,2018:546-554.圖2-8陽離子KLDD肽的設(shè)計(jì)和表征圖除了設(shè)計(jì)不同的多肽序列外，很多研究人員還通過在已知的多肽序列上修飾其它小分子，以獲得具有不同性能的多肽水凝膠。李新明等人[[]LiJ,LiX,YiK,etal.Self‐DeliveryMultifunctionalAnti‐HIVHydrogelsforSustainedRelease[J].AdvancedHealthcareMaterials,2013,2(12):1586-1590.]在分別在NapFFKYp和NxpFFKYp上修飾抗HIV藥物拉米夫定（3TC）和齊多夫定（AZT）合成四種新型凝膠因子NapFFK(3TC)Yp、NapFFK(AZT)Yp、NxpFFK(3TC)Yp和NxpFFK(AZT)Yp（圖2-9[]LiJ,LiX,YiK,etal.Self‐DeliveryMultifunctionalAnti‐HIVHydrogelsforSustainedRelease[J].AdvancedHealthcareMaterials,2013,2(12):1586-1590.圖2-9含有抗HIV藥物的凝膠因子的合成圖本課題也同樣是在NapFFKYp上修飾功能性分子，下節(jié)將簡(jiǎn)單介紹一下本課題用到的天然多酚沒食子酸和咖啡酸。2.2沒食子酸和咖啡酸沒食子酸（3,4,5-三羥基苯甲酸，簡(jiǎn)稱GA，如圖2-9a所示）和咖啡酸（3-(3,4-二羥基苯基)-丙烯酸，簡(jiǎn)稱CA，如圖2-9b所示）同屬天然多酚類物質(zhì)，主要由植物中提取而來。沒食子酸主要存在于五倍子植物中，咖啡酸則大量存在于麝香草等中草藥植物中。二者都具有一定的抗腫瘤和抗氧化作用[[]張雅麗,李建科,劉柳,等.五倍子沒食子酸研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2013,34(10):386-390.,[]孫皓熠,郝寶燕,張浩超,等.咖啡酸研究概況[J].食品與藥品,2017,19(2):151-152.][]張雅麗,李建科,劉柳,等.五倍子沒食子酸研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2013,34(10):386-390.[]孫皓熠,郝寶燕,張浩超,等.咖啡酸研究概況[J].食品與藥品,2017,19(2):151-152.圖2-9aGA的結(jié)構(gòu)式圖2-9bCA的結(jié)構(gòu)式

第三章設(shè)計(jì)目標(biāo)及可行性分析首先，本實(shí)驗(yàn)先利用固相合成法合成NapFFKYp，其主要流程如圖1-1所示。實(shí)驗(yàn)中加入的活化劑（DIEA和HBTU來）吸引羰基C上的電荷，降低C上的電荷密度，便于氨基的親核進(jìn)攻，形成肽鍵。重復(fù)操作，直到得到目標(biāo)多肽序列。以上述固相合成法合成NapFFKYp多肽分子后，利用縮合劑HOBT和DIC活化沒食子酸或咖啡酸上的羧基，使其易與NapFFKYp上的側(cè)鏈氨基發(fā)生反應(yīng)。其中HOBt的作用是將DIC與羧基反應(yīng)形成的活潑中間體轉(zhuǎn)化為另一比較穩(wěn)定的中間體，防止發(fā)生消旋化。用堿式磷酸酶（ALP）水解兩種凝膠因子NapFFK(GA)Yp和NapFFK(CA)Yp上的磷酯鍵，兩種分子的親疏水平衡發(fā)生改變而自組裝形成水凝膠。最后進(jìn)一步探究NapFF(GA)Yp和NapFF(CA)Yp分子的自組裝性能

第四章多肽的合成及修飾4.1實(shí)驗(yàn)材料4.1.1實(shí)驗(yàn)試劑：表4-1多肽合成及修飾所用試劑藥品純度/簡(jiǎn)稱生產(chǎn)廠家2-氯三苯甲基氯樹脂A.R.吉爾生化Fmoc氨基酸(F、K、Yp)A.R.1-羥基苯并三氮唑A.R./HOBT1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽A.R./HBTU2-萘乙酸A.R./Nap阿拉丁試劑（上海）有限公司沒食子酸A.R./GA上海源葉咖啡酸A.R./CAN,N-二異丙基碳二亞胺98%/DIC上海竺鑰化工有限公司二異丙基乙胺99%/DIEA上海泰坦科技股份有限公司二氯甲烷A.R./DCM江蘇強(qiáng)盛甲醇A.R./MeOH乙腈A.R./CH3CN鹽酸G.C./HClN，N-二甲基甲酰胺G.C./DMF上海麥克林生化科技有限公司正己烷A.R.國藥集團(tuán)哌啶A.R.碳酸鈉A.R./Na2CO3西隴化工股份有限公司三氟乙酸C.P./TFA上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司表4-2合成多肽用到的氨基酸及其簡(jiǎn)稱名稱英文縮寫結(jié)構(gòu)式苯丙氨酸phenylalaninePheF賴氨酸LysineLysK酪氨酸t(yī)yrosineTyrY4.1.2實(shí)驗(yàn)儀器表4-3：多肽合成及修飾所用儀器名稱型號(hào)廠家冷凍干燥機(jī)SCIENTZ-10N寧波新芝生物科技股份有限責(zé)任公司數(shù)控高超聲波清洗器KQ3200DE昆山市超聲儀器有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100EYELA公司高效液相色譜儀Waters2487蘇州科沃安生物科技有限公司MALDI-TOF質(zhì)譜儀AgilentAgilent公司超導(dǎo)核磁共振波譜儀INOVA-400MHZ安捷倫（瓦里安）公司

4.2實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1NapFFKYp的合成和純化本章采用固相合成法合成NapFFKYp多肽分子。實(shí)驗(yàn)開始前，應(yīng)保證所用溶劑無水。（i）將2-氯三苯甲基氯樹脂（0.5g，0.7mmol活性位點(diǎn)）溶解在無水DMF中，通氮?dú)夤臍庹鹗?0min，活化樹脂（調(diào)整氮?dú)饬魉俦ＷC樹脂不沉積在反應(yīng)器底部），除去反應(yīng)液，用無水DMF沖洗5次。（ii）將Fmoc-Tyr(PO3H2)-OH（845.44mg，1.75mmol）的DMF溶液加入反應(yīng)器中，通氮?dú)夤臍庹鹗?.5h，除去反應(yīng)液，用無水DMF沖洗4次。（iii）將猝滅試劑（體積比DCM:MeOH:DIEA=16:3:1的混合液）加入反應(yīng)器中，通氮?dú)夤臍庹鹗?5min，除去反應(yīng)液，再將上述淬滅試劑加入反應(yīng)器中，通氮?dú)夤臍庹鹗?5min，除去反應(yīng)液，用無水DMF沖洗4次。（iv）將含20%哌啶的DMF溶液（脫保護(hù)劑）加入反應(yīng)器中，通氮?dú)夤臍庹鹗?0min，除去反應(yīng)液，用脫保護(hù)劑沖洗3次，用無水DMF沖洗4次。（v）將含F(xiàn)moc-Lys-OH（819.875mg，1.75mmol）、HBTU（657.14mg，1.73mmol）、DIEA（0.76mL）的DMF溶液加入反應(yīng)器中，通氮?dú)夤臍庹鹗?h，除去反應(yīng)液，用無水DMF沖洗4次。（vi）重復(fù)（iv）、（v）步驟，將Fmoc-Phe-OH（678.04mg，1.75mmol）和Fmoc-Phe-OH（678.04mg，1.75mmol）和Nap（325.87mg，1.75mmol）接到多肽序列上。除去反應(yīng)液，用DMF、DCM、MeOH、正己烷各沖洗5次，然后用泵吹干。（vii）將95%的三氟乙酸(TFA)加入反應(yīng)器中，通氮?dú)?~3h，切去樹脂，然后用泵吹干得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用水溶解，調(diào)節(jié)pH到8左右，待粗產(chǎn)物完全溶解后再將pH調(diào)到6~7，低溫下保存待純化。（viii）取適量粗產(chǎn)物用水溶解，用Na2CO3調(diào)節(jié)pH到8~9，待粗產(chǎn)物完全溶解后再將pH調(diào)至7，高效液相色譜（HPLC）分離。圖4-1NapFFKYp的固相合成路線圖4.2.3NapFFK(GA)Yp的合成將GA（20mg，0.118mmol）溶于DMF和DCM的混合溶液（DMF:DCM=1:4）中，加入HOBT（31.76mg，0.235mmol）溶解，再滴加36.41μLDIC，攪拌12h，薄層色譜（TCL）檢測(cè)活化效果（展開劑為CH3CN:H2O=10:1）。將NapFFKYp(83.4mg，0.095mmol)溶于水，加入Na2CO3調(diào)節(jié)至pH=8~9，再加入適量DMF。將活化好的GA溶液用旋蒸儀旋蒸，將旋蒸后的溶液緩慢滴加到NapFFKYp中，過夜反應(yīng)，TCL檢測(cè)反應(yīng)程度。反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH=7，用泵吹干，高效液相色譜分離。圖4-2NapFFK(GA)Yp的合成路線圖4.2.4NapFFK(CA)Yp的合成將CA（20mg，0.111mmol）溶于DMF和DCM的混合溶液（DMF:DCM=1:4）中，加入HOBT（30mg，0.222mmol）溶解，再滴加34.38μLDIC，攪拌12h，薄層色譜（TCL）檢測(cè)活化效果（展開劑為CH3CN:H2O=10:1）。將NapFFKYp(83.4mg，0.090mmol)溶于水，加入Na2CO3調(diào)節(jié)至pH=8~9，再加入DMF。將活化好的CA溶液用旋蒸儀旋蒸，將旋蒸后的溶液緩慢滴加到NapFFKYp中，過夜反應(yīng)，TCL檢測(cè)反應(yīng)程度。反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH=7，用泵吹干，高效液相色譜分離。圖4-3NapFFK(CA)Yp的合成路線圖

4.3產(chǎn)物分子的化學(xué)分析與測(cè)試4.3.1質(zhì)譜首先將樣品溶解到CHCl3中，制成濃度為10mg/mL的溶液，采用常用的三明治點(diǎn)樣法進(jìn)行點(diǎn)樣[[]向弘,朱斌,徐昕榮,等.基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜在高分子聚合物研究應(yīng)用中的樣品制備方法[J].廣東化工,2009,36(8):85-86.]，[]向弘,朱斌,徐昕榮,等.基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜在高分子聚合物研究應(yīng)用中的樣品制備方法[J].廣東化工,2009,36(8):85-86.圖4-6NapFFKYp的質(zhì)譜圖圖4-7NapFFK(GA)Yp的質(zhì)譜圖圖4-8NapFFK(CA)Yp的質(zhì)譜圖表4-6所得產(chǎn)物的理論分子量與實(shí)測(cè)分子量(M+Na)+的比較分子理論分子量實(shí)測(cè)(M+Na)+NapFFKYp874.320874.568NapFFK(GA)Yp1026.3301026.329NapFFK(CA)Yp1036.3511036.307由表4-6可知，合成產(chǎn)物質(zhì)譜的(M+Na)+特征峰明顯且符合理論值，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。4.3.2核磁共振氫譜（1HNMR）表征以氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)作為溶劑，送樣到蘇州大學(xué)分析測(cè)試中心檢測(cè),測(cè)得的1HNMR譜圖如下：

圖4-9NapFFKYp的1HNMR譜圖圖4-10NapFFK(GA)Yp的1HNMR譜圖圖4-11NapFFK(CA)Yp的1HNMR譜圖由1HNMR譜圖知，產(chǎn)物中不同化學(xué)環(huán)境的氫的個(gè)數(shù)和化學(xué)位移與目標(biāo)產(chǎn)物中的相似。4.3.3核磁共振磷譜（31PNMR）表征圖4-12NapFFKYp的31PNMR譜圖圖4-13NapFFK(GA)Yp的31PNMR譜圖圖4-14NapFFK(CA)Yp的31PNMR譜圖由31PNMR譜圖知，產(chǎn)物中始終存在磷酯鍵，并且化學(xué)位移相似，符合目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)要求，結(jié)合質(zhì)譜和氫譜的測(cè)試結(jié)果可證實(shí)本實(shí)驗(yàn)成功合成了NapFFK(GA)Yp和NapFFK(CA)Yp第五章多肽分子自組裝形成的水凝膠的性能研究5.1實(shí)驗(yàn)材料5.1.1實(shí)驗(yàn)試劑表5-1水凝膠的性能研究用到的試劑試劑純度廠家磷鎢酸負(fù)染液2%上海源葉生物科技有限公司堿式磷酸酶1U/μL賽默飛世爾科技(中國)有限公司5.1.2實(shí)驗(yàn)儀器表5-2水凝膠的性能研究用到的儀器儀器型號(hào)廠家流變儀HAAKERheoStress6000ThermoScient