附件2：兩面針5種成分含量測定 高效液相色譜一測多評法（征求意見稿）

Q/LB.□XXXXX-XXXXII前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園提出、歸口并宣貫。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)藥用植物園、廣西廣林正山藥業(yè)有限公司、深圳市中藥制造業(yè)創(chuàng)新中心有限公司、華潤三九醫(yī)藥股份有限公司。本文件主要起草人：朱艷霞、喬麗婭、胡鳳云、彭玉德、夏祥華、付金娥、張洪勝、馬慶、陳劍洪、劉光快、陸日文、唐真郎、李浩通。引言兩面針，為蕓香科植物兩面針（Zanthoxylumnididum(Roxb.)DC.）的干燥根，是廣西大宗道地藥材。兩面針中含有生物堿類、黃酮類、香豆素類、倍半萜類、木脂素類等多種化學(xué)成分，具有抗炎、抗菌、抗癌、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性。一測多評法是利用中藥有效成分內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，通過測定其中一種成分而實現(xiàn)多種成分的同步測定，具有成本低、方法簡便等特點，在中藥材多指標(biāo)質(zhì)量評價中具有廣泛的應(yīng)用前景?，F(xiàn)行兩面針質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅以氯化兩面針堿為指標(biāo)性成分，難以全面評價其質(zhì)量。針對這一現(xiàn)狀，項目組研究制定了兩面針中5種成分的高效液相色譜一測多評測定方法，以保障兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量和安全性。兩面針5種成分含量測定高效液相色譜一測多評法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了一測多評法測定兩面針中木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿等5種化學(xué)成分的含量的原理、試劑、儀器、色譜條件、測定步驟、結(jié)果計算和精密度。本文件適用于兩面針?biāo)幉闹心咎m花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿含量的測定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。術(shù)語和定義下列術(shù)語和文件適用于本文件。一測多評法Quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker通過中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,通過測定中藥中某個代表性成分的含量，依據(jù)相對校正因子可計算出該中藥中其他多種待測成分的含量，使其計算值與實測值符合定量方法學(xué)要求的一種多指標(biāo)同步質(zhì)量控制方法。相對校正因子Relativecorrectionfactor是一種修正因子，它的主要作用是修正測量值，以獲得更準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)，提高研究質(zhì)量，它的計算公式為某組分的絕對校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對校正因子之比。原理在同時測定兩面針多個指標(biāo)質(zhì)量成分的含量時，以兩面針中典型成分氯化兩面針堿做內(nèi)參物，分別求出內(nèi)參物與木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿等其它4個待測成分間的相對校正因子，并把相對校正因子作為一個常數(shù)用于相應(yīng)成分的含量測定。試劑氯化兩面針堿：分析標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%，化學(xué)式C21H18ClNO4，分子量383.83。甲醇：色譜純。乙腈：色譜純。儀器高效液相色譜儀：含四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器、柱溫箱和程序升溫控制系統(tǒng)。分析天平：精度0.1mg。超聲波清洗儀：功率≥500W。色譜條件AgilentEclipseC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相20%乙腈-0.1%甲酸（三乙胺調(diào)節(jié)pH至4.5）；體積流量1.0mL/min；柱溫30℃；檢測波長273、284nm；進樣量10μL。測定步驟制備樣品溶液精密稱定兩面針?biāo)幉姆勰健?.5mm）1.0g，置于具塞錐形瓶中，加6mL的70%甲醇置于超聲波清洗儀中超聲提取30min，重復(fù)3次，合并提取液，用70%甲醇定容至50mL量瓶中，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試樣品溶液。制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液用分析天平精密稱取氯化兩面針堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，用70%甲醇溶解并定容至25mL，制備成0.05mg/mL的對照品貯備液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。然后從貯備液中分別精確量取5、2、1、0.4mL，用70%甲醇定容至10mL，即得0.025、0.01、0.005、0.002mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分別吸取10μL濃度為0.05、0.025、0.01、0.005、0.002mg/mL的氯化兩面針堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次注入高效液相色譜儀，按“7”的色譜條件，測定氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的峰面積As、A1、A2、A3和A4，以氯化兩面針堿峰面積（As）為縱坐標(biāo)，對照品濃度（Cs）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果計算測定氯化兩面針堿含量吸取10μL樣品溶液注入高效液相色譜儀，按第“7”點的色譜條件，測定氯化兩面針堿的峰面積（As），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出氯化兩面針堿濃度（Cs）。計算木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的含量根據(jù)一測多評法確定木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的相對校正因子f1、f2、f3、f4分別為0.376、0.210、0.825、1.301。根據(jù)公式計算木蘭花堿濃度（C1）：C1=f1×Cs×A1/As。根據(jù)公式計算橙皮苷濃度（C2）：C