【生物】基因工程的基本操作程序課件-2023-2024學(xué)年高二下人教版選擇性必修三

第2節(jié)基因工程的基本操作程序DNA合成儀

我國是棉花的生產(chǎn)和消費大國。棉花在種植的過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。棉鈴蟲可以使棉花產(chǎn)量減少三分之一，嚴(yán)重時，甚至能使一片棉田絕收。大量施用農(nóng)藥殺蟲，不僅會提高生產(chǎn)成本，還可能造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉(使棉鈴蟲死亡，左）與非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（右）

科學(xué)家將蘇云金桿菌的“殺蟲基因”——Bt抗蟲蛋白基因轉(zhuǎn)到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白（蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白）——破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。

從社會中來

1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎？蘇云金桿菌與載體拼接普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取導(dǎo)入抗蟲基因（Bt抗蟲蛋白基因）重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測與鑒定實例：(含抗蟲基因）（含有并表達(dá)抗蟲基因）目的基因的篩選與獲取目的基因1.概念：用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因；如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。主要是編碼特定蛋白質(zhì)的基因，也可以是具有調(diào)控作用的因子一資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因2.篩選目的基因最有效的方法之一是從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會和可能。蘇云金桿菌的殺蟲作用于Bt基因有關(guān)掌握了Bt基因的序列信息對Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物-Bt抗蟲蛋白有較為深入的了解蘇云金桿菌制劑可防治棉花蟲害Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因?qū)嵗阂荒康幕虻暮Y選和獲取思考：1.Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理是什么？2.抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產(chǎn)生危害？

當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響一目的基因的篩選和獲取3.目的基因的獲取?獲取目的基因的方法：①從基因文庫中獲取②人工合成③利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因前提：方法：DNA合成儀基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成基因組文庫（某生物全部基因）部分基因文庫（主要是cDNA文庫）（三）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR的概念PCR是____________的縮寫，是一項根據(jù)__________的原理，在____提供參與DNA復(fù)制的_______與_______，對__________________進(jìn)行________的技術(shù)。①全稱：______________________________②原理：______________________________③操作環(huán)境：__________________________④目的：______________________________⑤優(yōu)點：______________________________聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的核苷酸序列大量復(fù)制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制可以在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因（以指數(shù)形式擴(kuò)增）PCR擴(kuò)增儀DNA復(fù)制所需的基本條件:參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈（模板）4種脫氧核苷酸（原料）DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈（氫鍵）催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（PCR用耐高溫的DNA聚合酶）（PCR用高溫代替）（PCR的引物2種）引物是一小段能與

的一段堿基序列__________的____________DNA母鏈互補配對短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物3’5’DNA母鏈（通常20-30個核苷酸）其他條件：一定的緩沖溶液(維持反應(yīng)體系的pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶的活性）、

控制溫度變化DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所遵循原則條件解旋方式酶特點結(jié)果PCR技術(shù)vsDNA復(fù)制堿基互補配對原則堿基互補配對原則模板、4種脫氧核苷酸、酶、ATP、引物模板、4種脫氧核苷酸、酶、引物(2種）DNA在高溫下熱變性解旋解旋酶催化半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）大量的DNA片段形成整個DNA分子耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶等PCR反應(yīng)引物是一小段DNA體內(nèi)DNA復(fù)制引物為一小段RNA

PCR的兩種引物的要求？

①不能自我環(huán)化②兩種引物之間不能互補配對③長度不宜過短過程

目的基因DNA________后_______，____與單鏈相應(yīng)________結(jié)合；然后以_______為模板在________作用下進(jìn)行_____，即將4種_________加到__________，如此___________。每次循環(huán)一般可以分為_____、_____、_____三步。受熱變性解為單鏈引物延伸互補序列單鏈DNADNA聚合酶引物的3’端脫氧核苷酸重復(fù)循環(huán)多次變性復(fù)性延伸PCR技術(shù)基本過程3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性當(dāng)溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復(fù)性（退火）當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’變性復(fù)性延伸條件：DNA模板、4種脫氧核苷酸、2種引物和TaqDNA聚合酶注：不需要ATP;由dNTP水解供能PCR技術(shù)第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪循環(huán)的產(chǎn)物完成后，常采用

來鑒定PCR的產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果呈___________（n次擴(kuò)增循環(huán)后，DNA數(shù)量約為___）*為什么呈指數(shù)形式擴(kuò)增？______________________________________________________________________________________指數(shù)形式擴(kuò)增2n一個循環(huán)得到的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍n代后，共消耗_____個引物；第____代出現(xiàn)完整的目的基因2n+1-23思考：1.變性過程破壞的是哪種化學(xué)鍵？是否需要酶？2.引物是什么？在復(fù)性過程中引物結(jié)合到模板鏈的哪一端？3.使用的一對引物的序列相同嗎？4.PCR過程是否需要ATP供能？5.PCR為什么需要引物？氫鍵不需要酶，需要90℃以上的高溫短單鏈核酸3’端不需要，由dNTP水解供能DNA復(fù)制不能從頭開始，DNA聚合酶只能由5′端向3′端延伸子鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴(kuò)增

不相同，目的基因兩端具有不同的核苷酸序列*兩種引物才能確保DNA的兩條鏈同時被擴(kuò)增（體內(nèi)DNA復(fù)制）①全稱：②操作環(huán)境：③原理：④前提：⑤條件：⑥過程：⑦優(yōu)點：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）可以在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因（以指數(shù)形式擴(kuò)增）DNA半保留復(fù)制已知目的基因的一段核苷酸序列（為了合成引物）模板DNA、4種游離脫氧核苷酸、引物（2種）、耐高溫的DNA聚合酶變性：復(fù)性：延伸：DNA解鏈（超過90℃）引物結(jié)合到互補DNA鏈（50℃左右）Taq酶從引物起始進(jìn)行互補鏈的合成（72℃左右）模板、原料、引物、酶、能量回顧：PCR技術(shù)用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。1.逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA過程基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心步驟）二基因表達(dá)載體重組DNA分子目的基因DNA限制酶限制酶DNA連接酶載體②能自我復(fù)制①有一個至多個限制酶切割位點③具有標(biāo)記基因

④對受體細(xì)胞無毒載體應(yīng)具備條件：限制酶切割位點標(biāo)記基因復(fù)制原點載體的種類：質(zhì)粒（常用）、噬菌體、動植物病毒目的基因DNA限制酶切割位點標(biāo)記基因復(fù)制原點①

;②

?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建二——核心步驟啟動子：位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因下游的一段有特殊序列的DNA片段終止轉(zhuǎn)錄1.目的使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用2.組成標(biāo)記基因：目的基因：復(fù)制原點：鑒別或篩選含有重組DNA分子的受體細(xì)胞注意：目的基因必須插入到

與

之間。啟動子終止子DNA復(fù)制的起始位點。重組DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因DNA連接酶基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點質(zhì)粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶？基因表達(dá)載體的構(gòu)建二——核心步驟基因表達(dá)載體3.過程培育抗蟲棉的簡要過程載體自身環(huán)化片段間的連接目的基因自身環(huán)化載體自身環(huán)化目的基因與載體連接目的基因與目的基因連接載體與載體連接正向連接

反向連接目的基因11’22’122’1’22’1’1如何解決這一問題？單酶切缺點：

思考：如果用同一種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶處理后會出現(xiàn)幾種產(chǎn)物？(只考慮兩兩結(jié)合)①載體、目的基因自身環(huán)化；②載體與目的基因反向連接雙酶切！3種《報紙44期》P2左aba’b’旁欄思考題2.將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？

有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物的總DNA提取出來，花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒有進(jìn)行基因表達(dá)載體的構(gòu)建。這種方法針對性差，完全靠運氣也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（雙子葉植物和裸子植物常用）基因槍法（單子葉植物常用）花粉管通道法2.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法：書本P80~P82——顯微注射法——Ca2+轉(zhuǎn)化法（我國科學(xué)家獨創(chuàng)）1.轉(zhuǎn)化的概念：

目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)_____和_____的過程。受體細(xì)胞維持穩(wěn)定表達(dá)（受精卵）（原核生物）花粉管通道法（我國獨創(chuàng)）②在植物授粉后一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。簡便經(jīng)濟(jì)，但要求花朵較大方法：實例：優(yōu)缺點：我國“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）

能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種

植物也取得了成功。農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有

，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞時，Ti質(zhì)粒的

可轉(zhuǎn)移至被侵染的細(xì)胞，并整合到該細(xì)胞的

。2.轉(zhuǎn)化原理：1.農(nóng)桿菌的特點：受體細(xì)胞為植物體細(xì)胞T-DNATi質(zhì)粒大型環(huán)狀DNA農(nóng)桿菌T-DNA染色體DNA上單子葉Ti質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體時，目的基因該插到Ti質(zhì)粒哪里？T—DNA上Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞目的基因插入植物細(xì)胞染色體DNA上表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）3.過程：植物組織培養(yǎng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入①兩次拼接:第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上。

第二次拼接(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細(xì)胞的

染色體DNA上。②兩次導(dǎo)入:第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌。

第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞?！督鸢妗稰93方法規(guī)律1.顯微注射法導(dǎo)入動物細(xì)胞——顯微注射法將含目的基因的表達(dá)載體提純受精卵顯微注射含目的基因的受精卵具有新性狀的動物雌性動物輸卵管或子宮胚胎移植早期胚胎

細(xì)胞

處理大腸桿菌細(xì)胞

Ca2+感受態(tài)

與感受態(tài)細(xì)胞混合細(xì)胞吸收DNA分子基因表達(dá)載體使細(xì)胞處于一種能夠吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的生理狀態(tài)。注：原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。導(dǎo)入微生物細(xì)胞——Ca2+轉(zhuǎn)化法因為沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體對蛋白質(zhì)進(jìn)一步加工?！秷蠹垺?4期P2右四目的基因的檢測與鑒定①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——“抗原—抗體雜交技術(shù)”2.個體生物學(xué)水平鑒定1.分子水平檢測抗性檢測：功能活性比較：PCR技術(shù)

或分子雜交技術(shù)目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志：合成相關(guān)蛋白質(zhì)抗蟲、抗病接種實驗；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性比較——檢測是否具有抗性以及抗性強度等方法—檢測目的基因在受體細(xì)胞中是否穩(wěn)定維持和表達(dá)目的基因的檢測與鑒定（小結(jié)）PCR目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志：合成相關(guān)蛋白質(zhì)—檢測目的基因在受體細(xì)胞中是否穩(wěn)定維持和表達(dá)①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因生物提取DNADNA作為模板PCR操作M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果DNA半保留復(fù)制原理：四目的基因的檢測與鑒定是否擴(kuò)增出目的基因以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）電泳操作原因：帶標(biāo)記的基因探針，與目的基因DNA單鏈在一定條件下互補配對，結(jié)合成雙鏈，從而出現(xiàn)雜交帶。四目的基因的檢測與鑒定①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因酶切轉(zhuǎn)膜標(biāo)記的DNA/RNA探針DNA分子雜交（Southern-blot)流程圖以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）方法2：

DNA分子雜交技術(shù)堿基互補配對原理：②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：PCR擴(kuò)增或分子雜交技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物提取RNARNA作為模板PCR操作電泳是否擴(kuò)增出目的基因逆轉(zhuǎn)錄cDNA四目的基因的檢測與鑒定提取RNA轉(zhuǎn)膜標(biāo)記的DNA/RNA探針RNARNA分子雜交流程圖以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）過程：用探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：

抗原與抗體的特異性結(jié)合原理：蘇云金芽孢桿菌提取Bt抗蟲蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交轉(zhuǎn)基因生物四目的基因的檢測與鑒定放射性檢測

（雜交帶）以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）過程：提取轉(zhuǎn)基因植物的蛋白質(zhì)+相應(yīng)抗體→是否出現(xiàn)雜交帶抗原—抗體雜交技術(shù)2.個體生物學(xué)水平鑒定沒有抗蟲基因的棉花植株有抗蟲基因的棉花植株棉鈴蟲沒有死亡棉鈴蟲死亡接種棉鈴蟲四目的基因的檢測與鑒定以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）轉(zhuǎn)Bt基因非轉(zhuǎn)基因基因工程的基本操作步驟獲取質(zhì)粒、噬菌體等載體篩選和獲取目的基因用限制酶切割載體和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA連接酶連接，構(gòu)建基因表達(dá)載體將含有目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞檢測和鑒定目的基因是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性1.目的基因的篩選和獲取-前提2.構(gòu)建基因表達(dá)載體-核心3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-關(guān)鍵4.目的基因的檢測與鑒定-保證利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、Ca2+轉(zhuǎn)化法(微生物);分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等。一、概念檢測1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因加整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細(xì)胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）將加基因整合到Ti質(zhì)粒上就是構(gòu)建基因表達(dá)載體。（

）（2）構(gòu)建含有加基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。（

）（3）只要檢測出番茄細(xì)胞中含有物基因，就代表抗凍番茄培育成功。（

）2.利用PCR既可以快速擴(kuò)增特定基因，也可以檢測基因的表達(dá)。下列有關(guān)PCR的敘述錯誤的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶C.復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補配對原則D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸√××D（1）科學(xué)家在培育“黃金大米”時，將ctrⅠ和psy基因?qū)牒琾mi基因的質(zhì)粒中，構(gòu)建了質(zhì)粒pSYN12424。該項研究的目的基因是

，標(biāo)記基因是

，質(zhì)粒pSYN12424的作用是______。ctrⅠ基因和psy基因pmi基因?qū)⒛康幕蛩腿胨炯?xì)胞（2）在構(gòu)建質(zhì)粒載體時，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識別序列？為什么？不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識別序列，限制酶可能將它切斷。二、拓展應(yīng)用（限制酶不能切割目的基因）探究·實踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實踐·探究一、實驗原理1.DNA體外擴(kuò)增（PCR）的原理PCR利用了DNA熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的

與

。PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。PCR的產(chǎn)物一般通過

來鑒定。2.DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷

的電極移動，這個過程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與

等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的

下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳相反解聚結(jié)合凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像紫外燈PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA擴(kuò)增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液瓊脂糖和核酸染料等二、材料用具用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，每吸取一種試劑后，其上的槍頭都必須更換自動調(diào)控溫度，實現(xiàn)DNA的擴(kuò)增微量移液器一次性吸液槍頭條件PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5ul20mmol/l的4種脫氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l的引物I2.5ul20umol/l的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul的TaqDNA聚合酶1-2U模板DNA5-10ul總體積50ul注：模板DNA的用量為1pg-1ug二、材料用具

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實踐·探究三、方法步驟用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使

。參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min移液離心擴(kuò)增

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實踐·探究PCR技術(shù)反應(yīng)液集中在離心管的底部使DNA充分變性，以利于引物更好地與模板結(jié)合PCR實驗操作過程根據(jù)待分離DNA片段的大小，用

配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的

混勻。