纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座

內(nèi)容

1背景

2纖維素及纖維素酶介紹

3國(guó)內(nèi)外纖維素酶研究熱點(diǎn)纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第1頁(yè)研究背景

能源危機(jī)

高油價(jià)，石油、天然氣等化石燃料枯竭,如石油大約為1180~1510億噸，大約在2050年左右枯竭，天然氣貯備預(yù)計(jì)在131800~152900兆立方米。年開采量維持在2300兆立方米，將在57~65年內(nèi)枯竭。煤儲(chǔ)量約為5600億噸，能夠供給169年。糧食緊缺

全世界饑餓人口：10億纖維素乙醇

原料起源廣:作物秸稈

(1.5×1012T/年)，大部分以焚燒形式被處理掉，造成大量資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。價(jià)格低：50美分/加侖（美國(guó)Novozymes企業(yè)）工業(yè)用酶需求增大

酶產(chǎn)值：1×1010美元/年

纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第2頁(yè)Worldenergyusagewidthchart纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第3頁(yè)汽油價(jià)格纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第4頁(yè)FLAGPOLICYDURINGTHE1973oilcrisis

1979energycrisis

纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第5頁(yè)Lineatagasstation,June15,1979纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第6頁(yè)全球糧食危機(jī)纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第7頁(yè)糧農(nóng)組織食品價(jià)格指數(shù)和農(nóng)產(chǎn)品價(jià)格指數(shù)

纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第8頁(yè)StrawsofCrop纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第9頁(yè)纖維素分子結(jié)構(gòu)分子量：

1.5×106～1.84×106，相當(dāng)于11300個(gè)葡萄糖殘基，這些纖維素分子以氫鍵組成平行微晶束，約60個(gè)為1束。纖維素彎曲模型:Hermans(20世紀(jì)40年代)提出纖維素(Cellulose)是植物細(xì)胞壁主要組分之一,占植物秸稈干質(zhì)量40%～50%。纖維素(Cellulose)：是由D-吡喃型葡萄糖基經(jīng)β-1,4糖苷鍵聯(lián)結(jié)而成直鏈多糖直鏈狀大分子纖維素折迭起來(lái)，形成含有高結(jié)晶基本組成單位，由這種基本組成單位集中起來(lái)組成微小結(jié)構(gòu)單位，再由很多微小單位組成纖維素。Figure1Hermans式纖維素椅式結(jié)構(gòu)纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第10頁(yè)纖維素酶介紹

纖維素酶：指由生物產(chǎn)生一個(gè)多組分混合蛋白質(zhì)，在適當(dāng)條件下，能使不溶性纖維素材料水解成可溶性糖生物催化劑總稱。

纖維素酶結(jié)構(gòu)

Fig.1Modelofcellulaseenzyme,producedbyT.fusca(禾草腥黑粉菌),basedonPDBstructure1JS4.催化活性中心到兩個(gè)含有獨(dú)立活性結(jié)構(gòu)域:含有催化功效結(jié)構(gòu)域(Catalyticdomain,CD),

含有結(jié)合纖維素功效結(jié)構(gòu)域(Cellulosebindingdomain,CBD),

二者之間由一段高度糖基化linker相連。整個(gè)分子呈楔形,球狀核區(qū)表示包含催化位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)CD區(qū)。少數(shù)沒(méi)有CBD。當(dāng)前被說(shuō)明催化結(jié)構(gòu)域T.reeseiCBHⅡ催化域結(jié)構(gòu),它是由α/β組成筒狀結(jié)構(gòu):由5個(gè)α螺旋和7條β鏈組成,活性部位由兩個(gè)延伸至表面環(huán)(loop)以形成一個(gè)隧道狀(tunnel)結(jié)構(gòu),長(zhǎng)度大約2nm,包含4個(gè)結(jié)合位點(diǎn),水解糖苷鍵發(fā)生在第2和第3結(jié)合位點(diǎn)之間。纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第11頁(yè)纖維素酶性狀真菌纖維素酶：以水解酶機(jī)制和氧化酶機(jī)制降解纖維素；細(xì)菌纖維素酶：形成多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)又稱纖維小體(Cellulosome)而起作用。能夠愈加徹底有效降解天然纖維素。白色，溶于水，高溫失活：最適溫度在45～65℃之間，受二苯乙烯苷、葡萄糖酸-1,5-內(nèi)酯等抑制表1產(chǎn)纖維素酶菌種特點(diǎn)纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第12頁(yè)纖維素酶作用機(jī)制

纖維二糖酶C1酶CＸ酶依據(jù)酶作用方式纖維素酶分為：纖維素酶

CＸ1酶：內(nèi)切型酶，它從水合非結(jié)晶纖維素分子內(nèi)部作用于β-（1，4)糖苷鍵，生成纖維糊精與纖維二糖。CＸ2酶：外切酶，它從水合性纖維素分子非還原端作用于β-（1，4)糖背鍵，逐步切斷β-(1,4)糖節(jié)鍵生成葡萄糖。纖維二糖酶則作用于纖維二糖，生成葡萄糖(何明清，1994)。Shoemaker、Goeran和Jinshce等人相繼發(fā)覺(jué)，內(nèi)切葡萄糖酶、纖維二糖水解酶及β-葡萄糖苷酶均存在2～4個(gè)同功酶，對(duì)于這些同功酶功效，當(dāng)前還未見(jiàn)有明確闡述，所以酶解機(jī)理還有待深入研究和探討。

當(dāng)前，已發(fā)覺(jué)70種纖維素酶。以上幾個(gè)酶往往相互協(xié)同作用纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第13頁(yè)CharacterofReaction

Hydrolysisof1,4-beta-D-glycosidiclinkagesincellulose,licheninandcerealbeta-D-glucans.

Fig.2

Characterof

HydrolysisReaction纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第14頁(yè)纖維素水解過(guò)程

Fig.3Mechanismofcellulolysis

Breakageofthenon-covalentinthecelluloseHydrolysisoftheindividualcelluloseitintosmallersugars

Hydrolysisofdisaccharidesandtetrasaccharidesintoglucose纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第15頁(yè)纖維素酶起源

真菌(mainly)：

木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬(Penicillium），如綠色木霉菌(Trichodermaviride),康寧木霉菌(Trichodermakoningii),黑曲霉（Asp.niger），繩狀青霉、變幻青霉等.

細(xì)菌:

好氧菌：如纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、噬胞菌屬（Cytophaga）厭氧菌：厭氧性芽孢梭菌屬（Clostridium）、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌（Bacteroidessuccinogenes）、牛黃瘤胃球菌（Ruminococcusflavefaciens）、白色瘤胃球菌（R.albus）、溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibriofibrisolvens）等超古菌：激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)等.

放線菌:好氧放線菌(Actinomycetales)：生二素鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)

高溫單孢菌屬(Thermomonospora):彎曲高溫單孢菌(Thermomonosporacurvata)及假諾卡氏菌屬等

植物、動(dòng)物及原生動(dòng)物(little):

蝸牛(snail),蟑螂(cockroaches)等.

纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第16頁(yè)纖維素酶應(yīng)用：纖維素酶食品生產(chǎn)醫(yī)藥生物燃料造紙洗滌劑紡織工業(yè)纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第17頁(yè)針對(duì)以上不知，國(guó)內(nèi)外研究主要集中在以下幾方面:1、菌種選育：構(gòu)建表示含有較高酶活力纖維素酶菌株;2、酶功效改造：經(jīng)過(guò)分子改造來(lái)提升酶功效性;3、經(jīng)過(guò)低成本發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)酶制劑：添加可溶性誘導(dǎo)劑，如槐糖(sophorose),纖維二糖(cellobiose),乳糖(lactose)和寡糖(cellooligosaccharides)纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第18頁(yè)纖維素酶在實(shí)際應(yīng)用不足(1)技術(shù)上：纖維素酶對(duì)溫度、濕度、酸堿度十分敏感,生產(chǎn)纖維素酶在保管、加工等過(guò)程中處理不妥就會(huì)失活,影響應(yīng)用效果。(2)標(biāo)準(zhǔn)上：纖維素酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、校驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn),尤其是添加纖維素酶后產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),在我國(guó)還是空白。取得成效與預(yù)期目標(biāo)相距甚遠(yuǎn),原因主要有2個(gè)：纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第19頁(yè)今后對(duì)纖維素酶研究會(huì)重點(diǎn)集中在:①纖維素酶高產(chǎn)菌株選育：

對(duì)菌株進(jìn)行改造,提升菌株生產(chǎn)能力及酶活性和穩(wěn)定性，篩選極端條件下纖維素酶高產(chǎn)菌株②優(yōu)化發(fā)酵條件：

改進(jìn)發(fā)酵工藝,降低生產(chǎn)成本,使發(fā)酵產(chǎn)物易于分離純化。③纖維素酶測(cè)定方法規(guī)范化：

包含要求標(biāo)準(zhǔn)菌株、標(biāo)準(zhǔn)測(cè)活方法、標(biāo)準(zhǔn)底物等。纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第20頁(yè)纖維素酶研究現(xiàn)實(shí)狀況BokJD.等人從Thermotoganeapolitana中分離純化到2個(gè)高熱穩(wěn)定性內(nèi)切纖維素酶CelA、CelB,編碼這2個(gè)內(nèi)切纖維素酶基因已經(jīng)被判定。Bronnenmeiar將一個(gè)起源于T.maritimaMSB8高熱穩(wěn)定性外切纖維素水解酶,最適溫度為95℃,pH在6.0～7.5,該酶能水解微晶纖維素、羧甲基纖維素和β-葡聚糖形成纖維二糖和纖維三糖。來(lái)自S.solfataricusMT4β-糖苷酶已被純化判定,該酶是一個(gè)同源四聚體,85℃以上對(duì)各種變性劑有極高抵抗力。編碼該酶基因已在大腸桿菌中克隆和高效表示。用擬南芥（Arabidopsisthaliana）葉片、馬鈴薯或煙葉來(lái)表示熱穩(wěn)定性好AcidothermuscellulolyticusendoglucanaseE1。纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第21頁(yè)1987年,Love在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中克隆了最適生長(zhǎng)溫度為65℃極端嗜熱厭氧菌（Caldocellumsaccharolyticum）β-葡萄糖苷酶,并完成測(cè)序。1996年Bergquist克隆棲熱菌耐熱纖維素酶耐熱溫度為70℃。1997年美國(guó)RBI企業(yè)開發(fā)103酶耐熱溫度100℃,最適酶促溫度70～80℃。1998年THOMAS克隆到Streptomycesviridosporus內(nèi)切纖維素酶基因并成功表示于Pichiapastoris中。年SPIRIDONOV嘗試用放線菌（Thermobifidafusca）進(jìn)行體外合成纖維素酶，發(fā)覺(jué)這一過(guò)程受celR基因調(diào)控。經(jīng)過(guò)對(duì)比celR基因突變型與野生型差異，發(fā)覺(jué)celR為組成型表示基因，其DNA結(jié)合活性受翻譯后修飾調(diào)控。年VANSolingen從湖底淤泥中篩選到了生產(chǎn)堿性纖維素酶放線菌菌株，經(jīng)16SrDNA測(cè)序，初步判定為鏈霉菌屬新種，并成功克隆到了纖維素酶基因cel12A，并將其利用大腸桿菌表示。纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第22頁(yè)纖維素酶生產(chǎn)液態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方式胡奎娟等研究了木霉和黑曲霉混合發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶和纖維素酶，結(jié)果為：木霉和黑曲霉按4:6同時(shí)接種，在84h產(chǎn)纖維素酶活力到達(dá)230IU/g干物質(zhì)，木聚糖酶活力到達(dá)1308IU/g干物質(zhì)，與兩菌純培養(yǎng)相比，纖維素酶活力提升163%，木聚糖酶活力提升79.5%。鄒水洋等對(duì)選育一株康寧木(Trichodermakoningii)QF202進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶.通搖瓶培養(yǎng)144h后，濾紙酶活1.49FPU/mL、β-葡萄糖苷酶活0.39U/mL、木聚糖酶活174.10U/mL.比一個(gè)商品纖維素酶糖化能力及總還原糖產(chǎn)量比商品纖維素酶分別提升了55%和40%,葡萄糖產(chǎn)量分別提升了33%和12%.纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第23頁(yè)

纖維素乙醇生產(chǎn)工藝pretreatment

Cellulosematerialcellulolysis

sugarsolution

fermentation

DistillationDehydration

95%alcoholover99.5%ethanolcellulase纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第24頁(yè)纖維素生產(chǎn)乙醇及其它化工產(chǎn)品關(guān)鍵纖維素糖化主要方法酸水解法：酸水解法中，稀酸水解所得糖化率低，高濃度強(qiáng)酸可有效水解纖維素，但其腐蝕性對(duì)人體有害，且所需工藝條件苛刻。酶水解法：用纖維素酶水解纖維素，在常溫、常壓條件下就能夠.所以，用纖維素酶降解纖維素是當(dāng)前纖維素利用研究中熱點(diǎn)。稀酸預(yù)處理-酶解法：美國(guó)可再生能源試驗(yàn)室開發(fā)發(fā)酵工藝?yán)w維素酶專業(yè)知識(shí)講座第25頁(yè)參考文件：[1]ZieglerMT，ThomasSR，DannaKJ.Accumulationofathermostableendo-1,4-β-D-glucanaseintheapoplastofArabidopsisthalianaleaves[J].Mol.Breed.，，6：37-46.[2]DaiZY，HookerBS，AndersonDB，etal.Improvedplant-basedproductionofE1endoglucanaseusingpotato：Expressionoptimizationandtissuetargeting[J].Mol.Breed.，，6：277-285.[3]GRAHAML.,etal.CharacteristicsofEnzymesProducedbyRuminococcusJlavefacienswhichDegradePlantCellWalls.JournalofGeneralMicrobiology.1979,110:21-27.[4]BARBELG.,etal.CellulolyticEnzymeSystemofThermoactinomycessp.GrownonMicrocrystallineCellulose.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY.1978,36(4):606-612.[5]HARRYJ.GILBERT,GEOFFREPY.HAZLEWOODBacterialcellulasesandxylanases.JournalofGeneralMicrobiology.1993,139:187-194.[6]FREJ.STUTZENBERGER.CellulolyticActivityofThermomonosporacurvata:OptimalAssayConditions,PartialPurification,andProductoftheCellulase.APPLiEDMlcaosioLoGy.1972,24(1):83-90.[7]P.0.OLUTIOLA.CellulolyticEnzymesinCultureFiltratesofRhizoctonialamellifera.JournalofGeneralMicrobiology.1976,97:251-256.[8]A.D.COUTTS.FactorsInfluencingtheProductionofCellulasesbySporotrichumthermophile.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY.1976,36(1):819-825.[9]MariamB.Sticklen.FeedstockCropGeneticEngineeringforAlcoholFuels.CROPSCIENCE.,47:2238-2246.[10]ELAINET.EVANS,etal.InvestigationofanendoglucanaseessentialfortheactionofthecellulasesystemofTrichodermareeseioncrystallinecellulose.Journalof'GeneralMicrobiology.1992,138:1639-1646.纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第26頁(yè)[11]ELAINET.EVANS.InvestigationofanendoglucanaseessentialfortheactionofthecellulasesystemofTrichodermareeseioncrystallinecellulose.Journalof'GeneralMicrobiology.1992,138:1639-1646.[12]Ta-TungWey,etal.MolecularCloningandSequenceAnalysisoftheCellobiohydrolaseIGenefromTrichodermakoningiiG-39.CURRENTMICROBIOLOGY.1994,28:31-39.[13]S.Zeilinger.,etal.NucleosometransactionsontheHypocreajecorina(Trichodermareesei)cellulasepromotercbh2associatedwithcellulaseinduction.MolGenGenomics.,270:46–55.[14]T.M.WOOD,etal.ObservationsontheComplexInteractionsInvolvedintheEnzymaticHydrolysisofCellulose.AppliedBiochemistryandBiotechnology.1984,9:313-315.[15]D.M.PHARR.PartialCharacterizationofCxCellulaseandCellobiasefromRipeningTomatoFruits1.PlantPhysiol.1973,51:577-583.[16]J.L.Wang,P.J.Gao.PCR-mediatedanalysisoftranscriptionofCBHIandIIgenesfromTrichodermapseudokoningiiandPenicilliumjanthinellum.BiotechnologyLetters.1999,21:321–324.[17]BASILJ.MACRIS.ProductionandCharacterizationofCellulaseandr-GlucosidasefromaMutantofAlternariaalternata.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY.1984,47(3):560-565.[18]K.MAHALINGESHWABRHAA,etal.PurificationandcharacterizationofanextracellularP-glucosidasefromthethermophilicfungusSporotrichumthermophileanditsinfluenceoncellulaseactivity.JournalofGeneralMicrobiology.1993,139:2825-2832.[19]THOMASM.WOOD,SHEILAI.McCRAE.PurificationandSomePropertiesoftheExtracellularP-D-GlucosidaseoftheCellulolyticFungusTrichodermakoningii.Journalof'GeneralMicrobiology.1982,128:2973-2982.[20]ERICA.JOHNSON,etal..SaccharificationofComplexCellulosicSubstratesbytheCellulaseSystemfromClostridiumthermocellum.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY.1982,43(5):1125-1132.纖維素酶專業(yè)知識(shí)講座第27頁(yè)[21]C.Thrane,etal..Substratecolonization,straincompetition,enzymeproductioninvitro,andbiocontrolofPythiumultimumbyTrichodermaspp.isolatesP1andT3.EuropeanJournalofPlantPathology.,

106:215–225.[22]T.M.Wood,etal..SynergismbetweencomponentsofthecellulasesystemoftheanaerobicrumenfungusNeocallimasUxfrontalisandthoseoftheaerobicfungiPenicilh'umpinophilumandl'richodermakoningiiindegradingcrystallinecellulose.ApplMicrobiolBiotechnol.1994,41:257-261.[23]Lakshmikant.Cellulosedegradationandcellulaseactivityoffivecellulolyticfungi.WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology.1990,6:64-66.[24]GEOFFIEYHALLIWELL,MOIAMMEDIIAZ.InteractionsbetweenComponentsofth