實驗三蛋白質(zhì)的等電點測定和沉淀反應(yīng)

關(guān)于實驗三蛋白質(zhì)的等電點測定和沉淀反應(yīng)實驗?zāi)康?/p>

1、了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。

2、學習測定蛋白質(zhì)等電點的一種方法。

3、加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認識。

4、了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實用意義。

5、了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。第2頁,共15頁，2024年2月25日，星期天實驗原理（一）蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：電場中移向陰極不移動移向陽極第3頁,共15頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的等電點:蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當溶液的pH達到一定數(shù)值時，蛋白質(zhì)顆粒上正負電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點。不同蛋白質(zhì)各有特異的等電點。在等電點時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點。最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。第4頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

本實驗通過觀察不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。

第5頁,共15頁，2024年2月25日，星期天（二）蛋白質(zhì)的沉淀

在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋?。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。（1）可逆的沉淀反應(yīng)此時蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。第6頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

（2）不可逆沉淀反應(yīng)此時蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固。蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機酸的反應(yīng)都屬于此類。蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。

第7頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

操作步驟（一）酪蛋白等電點的測定

1取同樣規(guī)格的試管4支，按下表順序分別精確地加入各試劑，然后混勻;2向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL，加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.5、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管pH即為酪蛋白的等電點。

第8頁,共15頁，2024年2月25日，星期天管號

蒸餾水（mL）

0.01mol/L醋酸(mL）0.1mol/L醋酸(mL)

1.0mol/L醋酸(mL)18.40.628.70.338.01.047.41.6第9頁,共15頁，2024年2月25日，星期天（二）蛋白質(zhì)的鹽析

無機鹽(硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等)的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當降低其鹽類濃度時，又能再溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程。第10頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

加蛋白質(zhì)溶液5mL于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管內(nèi)容物過濾，向濾液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止。此時析出沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。第11頁,共15頁，2024年2月25日，星期天（三）重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL，再加3%硝酸銀溶液1—2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？

第12頁,共15頁，2024年2月25日，星期天（四）某些有機酸沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL，再加入1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻傾出清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。

第13頁,共15頁，2024年2月25日，星期天（五）有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入2mL蛋白質(zhì)溶液,再加入2mL9