DNA高級結構、理化性質及應用2【可編輯的文檔】

一、DNA的雙螺旋結構及其意義

1953年，Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋（doublehelix)結構模型。

DNA雙螺旋結構要點：(Watson和Crick，1953)DNA由兩條反相平行的脫氧核苷酸鏈組成，脫氧核糖-磷酸骨架位于雙鏈的外側，堿基位于內側，雙鏈的堿基之間以氫鍵相結合。（堿基互補配對形式：A

T；GC)2.DNA是右手螺旋結構，螺旋直徑為2nm，螺距為3.4nm。堿基平面垂直螺旋軸，相鄰堿基平面距離為0.34nm，螺旋一圈包含10對堿基。3.氫鍵維持DNA雙鏈橫向穩(wěn)定性，堿基堆積力維持雙鏈縱向穩(wěn)定性。圖1-8DNA雙螺旋結構示意圖上述Watson和Crick的DNA雙螺旋結構稱為B型結構，是DNA分子在生理條件下最穩(wěn)定的結構，如果改變溶液的離子強度或相對濕度，DNA螺旋結構的上述特征就會發(fā)生變化。右手螺旋，11堿基/螺旋右手螺旋，10堿基/螺旋左手螺旋，12堿基/螺旋可能參與基因的表達和調控

DNA雙螺旋結構不同構型的意義并不在于其螺旋直徑及其高度的變化，關鍵是由于這些變化而引起的表面結構的改變，進而影響其生物學功能。

DNA雙螺旋的這種表面結構有助于DNA結合蛋白識別并結合特定的DNA序列。而這種表面構型的變化對基因組DNA與其DNA結合蛋白的特異性相互作用具有重要的意義。二、其它類型的DNA高級結構1、三股螺旋DNA

三股螺旋DNA也稱三鏈DNA（triplestrandDNA,tsDNA),其結構是在DNA雙螺旋結構的基礎上形成。雙螺旋通過Watson-Crick氫鍵穩(wěn)定，而三股螺旋沿需通過Hoogsteen氫鍵穩(wěn)定。三條鏈均為同型嘌呤（homopurine,Hpu)或同型嘧淀（homopyrimidine,Hpy),即整段的堿基均為嘌呤或嘧啶。

根據(jù)三鏈的組成和相對位置分為兩種基本類型：嘌呤-嘌呤-嘧啶型（Pu-Pu-Py型)：嘧啶-嘌呤-嘧啶型（Py-Pu-Py型)：——在堿性介質中穩(wěn)定——在偏酸性介質中穩(wěn)定三鏈中的兩條鏈為正常雙螺旋，第三條嘧啶鏈位于雙螺旋的大溝中，并隨雙螺旋結構一起旋轉。三鏈中堿基配對符合Hoogsteen模型：在Py-Pu-Py型中為：T=A=T、C+=G=C（與G形成Hoogsteen鍵的C必須質子化）；在Pu-Pu-Py中為：G=G=C、A=A=T

當DNA雙鏈中含有H-回文序列時，即某區(qū)段DNA兩條鏈分別為Hpu和Hpy，并且各自為回文結構時，任一條回文結構的5’

和3’部分都可以形成分子內三股螺旋及剩余的半條回文游離單鏈。在一定條件下，含回文序列DNA還可形成小瘤DNA（noduleDNA),它在中性溶液中穩(wěn)定。

真核生物基因組中存在大量可形成三鏈DNA的多聚嘌呤核苷酸和多聚嘧啶核苷酸序列。這些序列有的存在于調控區(qū)，有的位于DNA復制的起點或終點，有的則位于染色體重組位點，提示它們可能與基因的表達調控、DNA的復制及染色體的重組有關。2、十字型結構

十字型結構的分子基礎是DNA分子中存在翻轉重復序列。此時不僅兩條鏈互補。單鏈中的翻轉重復區(qū)也可以互相配對形成雙鏈分子。

DNA變性后或因其他原因引起DNA分子兩條鏈分開，再復性時翻轉重復區(qū)的DNA可以自我配對，形成突出于雙鏈之外的發(fā)夾結構，兩個并列的發(fā)夾形成十字結構。5’TCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAGGCCGTTTGTTTGTGGGCGACCATCGCCACCAAAAAAACAAACG5’GGTTACGGCCGCGATCGCGATATATTATATAGCGCTAGCGCCGGCATCAC5’---TCCGGCAAACTTTTGTTTGC------AGGCCGTTTGAAAACAAACG---5’

與DNA雙螺旋結構相比,十字形結構中氫鍵形成減少,而且失去了雙螺旋DNA堿基堆積力的相互作用,因而穩(wěn)定性不如雙螺旋DNA.

十字形結構可能在基因表達調控中起作用,但其確切的生物學功能有待研究.3.DNA的超螺旋結構

DNA雙螺旋進一步盤曲形成更加復雜的結構稱為DNA的三級結構,即超螺旋結構.

正超螺旋:DNA的盤曲方向與DNA雙螺旋方向相同.

負超螺旋:DNA的盤曲方向與DNA雙螺旋方向相反.(1)(2)核小體核心組蛋白第一層次折疊，體積減少6倍。第二層次折疊，直徑30nm纖絲，每周6個核小體，致密度增加40倍。第三層次折疊，30nm纖絲折疊成柱狀結構致密度增加約1000倍。在分裂期的染色體中，約1m長的DNA分子約壓縮8000-10000倍，容納于直徑只有數(shù)微米的細胞核中。超螺旋可能有兩方面的生物學意義:

超螺旋DNA比松馳型DNA更緊密,使DNA分子體積變得更小,對其在細胞的包裝過程更為有利;

超螺旋能影響雙螺旋的解鏈程序,因而影響DNA分子與其他分子(如酶、蛋白質）之間的相互作用。三、DNA的理化性質及應用(一)雙鏈DNA單鏈DNA(二)

在DNA解鏈過程中，由于更多的共軛雙鍵得以暴露，DNA在紫外區(qū)260nm處的吸光值增加，并與解鏈程度有一定的比例關系，這種關系稱為DNA的增色效應。

(三)四、核酸分子雜交的應用1、RNA酶保護分析（RibonucleaseProtectionAssay,RPA)

RPA是以液相雜交為基礎發(fā)展起來的，可用于基因和mRNA的結構分析以及mRNA的定量研究。

其原理為：在體外經(jīng)轉錄合成一個帶有標記的單鏈RNA探針，此探針與待測RNA在序列上互補，二者雜交后，用RNA酶處理，未形成雙鏈的RNA單鏈被水解成單核苷酸，雜交形成的雙鏈RNA受到保護，不被降解，然后通過電泳進行RNA-RNA雜交體的檢測。

RPA的檢測方法十分靈敏，結果可靠，是進行mRNA定量、mRNA末端定位以及確定內含子位置的常用方法?？俁NA標記探針雜交RNA酶水解滅活RNA酶沉淀RNAPAGE電泳膜轉移與生物素探針雜交洗膜、封閉膜與抗生物素蛋白-堿性磷酸酶一起孵育加入發(fā)光劑X光片曝光RNA酶保護分析示意圖：2、濾膜雜交：濾膜雜交是固相雜交的一種，是將待測核酸分子結合到不同的濾膜上，然后同存在于液相中的標記探針進行雜交。待測核酸樣品可以直接點在濾膜上（稱為斑點雜交）；也可以先將核酸樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，再通過印跡技術將核酸從凝膠中按原來的位置和順序轉移到濾膜上。這樣可以比較準確地保持待測核酸片段在電泳圖譜中的位置，同時又可以進行分子量測定。這一技術通常用于DNA的限制性內切酶圖譜分析、判斷DNA的限制性內切酶片段長度多態(tài)性以及DNA的定性、定量等研究。3、原位雜交(insituhybridization)：原位雜交是用標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交.這一方法可以保持組織或細胞的完整結構,因此可以精確地進行DNA或RNA在組織或細胞內的定位.此外,結合共聚焦顯微鏡的應用,這一方法還可以將特異的基因或DNA片段經(jīng)熒光標記后在染色體上進行定位(fluorescenceinsituhybridization,FISH).4、DNA芯片(DNAchips)：

DNA芯片技術是近年來發(fā)展起來的一項融合分子生物學與微電子等多學科的高新技術.其基本原理類似于原位雜交.在特定的固相支持物表面(常用計算機硅芯片)原位合成寡核苷酸,或者將預先制備的DNA片段以顯微打印的方式有順序地固化于支持物表面經(jīng)熒光、生物素或放射性核素標記的核酸樣品與之雜交具有與芯片DNA序列互補的核酸樣品即可與芯片上的探針結合通過對雜交信號的檢測分析，便可以得到樣