HJ 347.2-2018 水質(zhì) 糞大腸菌群的測(cè)定 多管發(fā)酵法（正式版）

中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法2018-12-26發(fā)布 1適用范圍 12規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 14方法原理 15干擾和消除 6試劑和材料 27儀器和設(shè)備 28樣品 39分析步驟 310結(jié)果計(jì)算與表示 511精密度和準(zhǔn)確度 512質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 613廢物處理 6附錄A(資料性附錄)最大可能數(shù)(MPN)表 7附錄B(資料性附錄)糞大腸菌群檢驗(yàn)記錄及報(bào)告推薦格式 為貫徹《中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)法》和《中華人民共和國(guó)水污染防治法》,保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中糞大腸菌群的測(cè)定方法，制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的多管發(fā)酵法。本標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)《水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法和濾膜法(試行)》(HJ/T347—2007)多管發(fā)本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布于2007年，原起草單位為中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站。本次為第一次修訂?！黾恿?2管法和15管法的檢出限；——分析步驟中增加了12管法，完善了樣品稀釋方法；——增加了規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、干擾和消除、儀器和設(shè)備、樣品采集、樣品保存、精密度和準(zhǔn)確度、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制、廢物處理等章節(jié)；——將MPN表移至附錄中。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A和附錄B為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)司、法規(guī)與標(biāo)準(zhǔn)司組織制訂。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省環(huán)境監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)中心。本標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證單位：大連市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、丹東市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站、錦州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站、遼陽(yáng)市環(huán)境監(jiān)測(cè)站、沈陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心和遼寧北方環(huán)境檢測(cè)技術(shù)有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)生態(tài)環(huán)境部2018年12月26日批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)自2019年6月1日起實(shí)施。水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法1適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水中糞大腸菌群的多管發(fā)酵法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測(cè)定。本方法的檢出限：12管法為3MPN/L;15管法為20MPN/L。2規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫(kù)采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ/T91地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。又稱耐熱大腸菌群(thermotolerantcoliforms)。44.5℃培養(yǎng)24h,能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。最大可能數(shù)mostprobablenumber(MPN)又稱稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)，是一種基于泊松分布的間接計(jì)數(shù)法。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標(biāo)微生物陽(yáng)性數(shù)，查表估算一定體積樣品中目標(biāo)微生物存在的數(shù)量(單位體積存在目標(biāo)微生物的最大可能數(shù))。4方法原理將樣品加入含乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，37℃初發(fā)酵富集培養(yǎng)，大腸菌群在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變?yōu)辄S色，產(chǎn)生的氣體進(jìn)入倒管中，指示產(chǎn)氣。44.5℃復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的膽鹽三號(hào)可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，最后產(chǎn)氣的細(xì)菌確定為是糞大腸菌群。通過(guò)查MPN表，得出糞大腸菌群濃度值。5干擾和消除5.1活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1)時(shí)加入硫代硫酸鈉溶液(6.7)消除干擾。25.2重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1)時(shí)加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.8)消除干擾。除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭┗蛏镌噭?，?shí)驗(yàn)用水為蒸餾水或去離將蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000ml水中，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml,充分混勻，分裝于含有倒置小玻璃管的試管中，115℃高壓蒸汽滅菌20min,儲(chǔ)存于冷暗處備用。也可選用市售成品培養(yǎng)基。6.2三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：稱取三倍的乳糖蛋白胨培養(yǎng)基(6.1)成分的量，溶于1000ml水中，配成三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，配制方法同上。胰胨20g乳糖5g將上述成分或含有上述成分的市售成品加熱溶解于1000ml水中，然后分裝于有玻璃倒管的試管中，115℃高壓蒸汽滅菌20min,滅菌后pH應(yīng)在6.9左右。6.4無(wú)菌水：取適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min,備用。6.5硫代硫酸鈉(Na?S?O?·5H?O)。6.6乙二胺四乙酸二鈉(C??H??N?O?Na?2H?O)。稱取15.7g硫代硫酸鈉(6.5),溶于適量水中，定容至100ml,臨用現(xiàn)配。稱取15g乙二胺四乙酸二鈉(6.6),溶于適量水中，定容至100ml,此溶液可保存30d。7儀器和設(shè)備7.1采樣瓶：500ml帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶。7.2高壓蒸汽滅菌器：115℃、121℃可調(diào)。7.3恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋：允許溫度偏差37℃±0.5℃、44℃±0.5℃。7.4pH計(jì)：準(zhǔn)確到0.1pH單位。37.5接種環(huán)：直徑3mm。7.7一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。8.1樣品采集點(diǎn)位布設(shè)及采樣頻次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。采集微生物樣品時(shí)，采樣瓶(7.1)不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。清潔水體的采樣量不低于400ml,其余水體采樣量不低于100ml。采集河流、湖庫(kù)等地表水樣品時(shí)，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，距水面10～15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶?jī)?nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒(méi)有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無(wú)菌包裝紙。從龍頭裝置采集樣品時(shí)，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開(kāi)至最大，放水3～5min,然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3min滅菌或用70%～75%的酒精對(duì)龍頭進(jìn)行消毒，開(kāi)足龍頭，再放水1min,以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時(shí)控制水流速度，小心接入瓶?jī)?nèi)。采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時(shí)，也可使用滅菌過(guò)的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液(6.7),以除去活性氯對(duì)細(xì)菌的抑制作用(每125ml容積加入0.1ml的硫代硫酸鈉溶液);如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.8),以消除干擾(每125ml容積加入0.3ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液)。8.2樣品保存采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測(cè)，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過(guò)6h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能立即開(kāi)展檢測(cè)的，將樣品于4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測(cè)。9分析步驟9.1樣品稀釋及接種9.1.115管法將樣品充分混勻后，在5支裝有已滅菌的5ml三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基(6.2)的試管中(內(nèi)有倒管),按無(wú)菌操作要求各加入樣品10ml,在5支裝有已滅菌的10ml單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基(6.1)的試管中(內(nèi)有倒管),按無(wú)菌操作要求各加入樣品1ml,在5支裝有已滅菌的10ml單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基(6.1)的試管中(內(nèi)有倒管),按無(wú)菌操作要求各加入樣品0.1ml。對(duì)于受到污染的樣品，先將樣品稀釋后再按照上述操作接種，以生活污水為例，先將樣品稀釋10?倍，然后按照上述操作步驟分別接種10ml、1ml和0.1ml。15管法樣品接種量參考表見(jiàn)表1。當(dāng)樣品接種量小于1ml時(shí)，應(yīng)將樣品制成稀釋樣品后使用。按無(wú)菌操作要求方式吸取10ml充分4混勻的樣品，注入盛有90ml無(wú)菌水(6.4)的三角燒瓶中，混勻成1:10稀釋樣品。吸取1:10的稀釋樣品10ml注入盛有90ml無(wú)菌水的三角燒瓶中，混勻成1:100稀釋樣品。其他接種量的稀釋樣品依次類推。生活飲用水等清潔水體也可使用12管法。表115管法樣品接種量參考表接種量/ml▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲處理后▲▲▲▲▲▲9.1.212管法將樣品充分混勻后，在2支裝有已滅菌的50ml三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基(6.2)的大試管中(內(nèi)有倒管),按無(wú)菌操作要求各加入樣品100ml,在10支裝有已滅菌的5ml三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基(6.2)的試管中(內(nèi)有倒管),按無(wú)菌操作要求各加入樣品10ml。9.2初發(fā)酵試驗(yàn)將接種(9.1)后的試管，在37℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h。發(fā)酵試管顏色變黃為產(chǎn)酸，小玻璃倒管內(nèi)有氣泡為產(chǎn)氣。產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的試管表明試驗(yàn)陽(yáng)性。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽(yáng)性。9.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)輕微振蕩在初發(fā)酵試驗(yàn)(9.2)中顯示為陽(yáng)性或疑似陽(yáng)性(只產(chǎn)酸未產(chǎn)氣)的試管，用經(jīng)火焰灼燒滅菌并冷卻后的接種環(huán)(7.5)將培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)接到裝有EC培養(yǎng)基(6.3)的試管中。在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h。轉(zhuǎn)接后所有試管必須在30min內(nèi)放進(jìn)恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋(7.3)中。培養(yǎng)后立即觀察，倒管中產(chǎn)氣證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。9.4對(duì)照試驗(yàn)每次試驗(yàn)都要用無(wú)菌水(6.4)按照步驟9.1～9.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定。9.4.2陽(yáng)性及陰性對(duì)照將糞大腸菌群的陽(yáng)性菌株(如大腸埃希氏菌Escherichiacoli)和陰性菌株(如產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacteraerogenes)制成濃度為300～3000MPN/L的菌懸液，分別取相應(yīng)體積的菌懸液按接種(9.1)的要求接種于試管中，然后按初發(fā)酵試驗(yàn)(9.2)和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(9.3)要求培養(yǎng)，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。5接種12份樣品時(shí)，查附錄A中表A.1可得每升糞示；當(dāng)測(cè)定結(jié)果低于檢出限時(shí)，12管法以“未檢出”或“<3MPN/L”表示；15管法以“未檢出”或“<20MPN/L”表示。糞大腸菌群檢驗(yàn)品(濃度為3670MPN/L,可接受范圍為330～7710MPN/L)進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為2.3%～3.8%、2.0%～11%、1.1%～5.4%和5.1%～17%;實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.4%、11%、1.6%和5.4%;實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間見(jiàn)表2。表2實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間低濃度/(MPN/L)中濃度/(MPN/L)高濃度/(MPN/L)有證標(biāo)準(zhǔn)樣品/(MPN/L)95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間9.6×103~7.9×10?2.2×10?~6個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)含糞大腸菌群濃度為3670MPN/L(可接受范圍為330～7710MPN/L)的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定：相對(duì)誤差范圍為-6.2%～8.4%;相對(duì)誤差最終值為-1.7%±10.6%。612質(zhì)量保證和質(zhì)量控制12.1培養(yǎng)基檢驗(yàn)更換不同批次培養(yǎng)基時(shí)要進(jìn)行陽(yáng)性和陰性菌株檢驗(yàn)，將糞大腸菌群的陽(yáng)性菌株(如大腸埃希氏菌Escherichiacoli)和陰性菌株(如產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacteraerogenes)制成濃度為300～3000MPN/L的菌懸液。若使用的是定性標(biāo)準(zhǔn)菌株，配制方法為先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸清濃度后按目標(biāo)為300~3000MPN/L稀釋；若使用的是定量標(biāo)準(zhǔn)菌株，則可按照給定值直接稀釋。稀釋后分別取相應(yīng)水量的菌懸液按接種(9.1)的要求接種于試管中，然后按初發(fā)酵試驗(yàn)(9.2)和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(9.3)要求培養(yǎng)，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。12.2對(duì)照試驗(yàn)12.2.1空白對(duì)照每次試驗(yàn)都要用無(wú)菌水做實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定(9.4.1),培養(yǎng)后的試管中不得有任何變色反應(yīng)。否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。12.2.2陽(yáng)性及陰性對(duì)照定期按照9.4.2進(jìn)行陽(yáng)性及陰性對(duì)照試驗(yàn)，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。13廢物處理使用后的廢物及器皿須經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30min或使用液體消毒劑(自制或市售)滅菌。滅菌后，器皿方可清洗，廢物作為一般廢物處置。7(資料性附錄)表A.112管法最大可能數(shù)(MPN)表10ml樣品量的陽(yáng)性管數(shù)100ml樣品量的陽(yáng)性瓶數(shù)0121L樣品中糞大腸菌群數(shù)1L樣品中糞大腸菌群數(shù)1L樣品中糞大腸菌群數(shù)04138273456789注：接種2份100ml樣品，10份10ml樣品，總量300ml。下限下限00030080027302002473023003303004730400593050102730204340263125037336049340531502043204026325022322602393230243248下限下限02532503063305031733703293320333303433403533504083407049348042342043343044344045345050935080535052352053353054354055355002740030440502640270