高效液相色譜法的新進(jìn)展

關(guān)于高效液相色譜法的新進(jìn)展第一節(jié)高效液相色譜的定義第2頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月定義

高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在色譜柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。第3頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月第二節(jié)儀器裝置第4頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

所使用的儀器為高效液相色譜儀，基本是由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集及處理等幾部分構(gòu)成。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。第5頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月高壓輸液系統(tǒng)

高效液相色譜輸液系統(tǒng)包括貯液罐、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置等。第6頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月貯液罐及流動(dòng)相

貯液罐貯液罐是一個(gè)存放流動(dòng)相（洗脫液）的容器,所以其結(jié)構(gòu)材料必須對(duì)流動(dòng)相是化學(xué)惰性的。常用的材料為玻璃、不銹鋼或表面噴涂聚四氟乙烯的不銹鋼等。容積一般為0.5～2升。第7頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

流動(dòng)相流動(dòng)相的配制應(yīng)首選色譜純?cè)噭?，水?yīng)用純化水。流動(dòng)相使用前應(yīng)先用0.45μm或更小孔徑微孔濾膜過(guò)濾，目的是除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無(wú)機(jī)鹽配制的緩沖液。其次，流動(dòng)相進(jìn)入高壓泵前應(yīng)脫氣，目的是除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡，如果不去除氣泡，會(huì)有以下情況發(fā)生：（1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積；（2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形；（3）檢測(cè)器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng)。脫氣的方法有加熱法、加壓法、超聲去除法、惰性氣體置換法及在線脫氣法。第8頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相首選甲醇—水系統(tǒng)（采用紫外末端波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)首選乙腈—水系統(tǒng)）。乙腈與甲醇相比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）乙腈洗脫能力較強(qiáng)（40%乙腈約相當(dāng)于50%甲醇，相當(dāng)于30%四氫呋喃）；（2）乙腈具有良好的溶解能力，能使色譜峰的峰形更加對(duì)稱(chēng)；（3）乙腈與水能夠較好的互溶，并且黏度較甲醇—水?。唬?）乙腈的截止波長(zhǎng)是有機(jī)溶劑中最低的，高純度乙腈截止波長(zhǎng)為190nm。第9頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月但同時(shí)具有以下缺點(diǎn)：（1）乙腈價(jià)格較甲醇昂貴；（2）在低pH條件下，磷酸鹽在乙腈溶液中溶解度較小，有研究表明，當(dāng)乙腈接近50%（體積分?jǐn)?shù)）且磷酸鹽緩沖鹽達(dá)0.050mmol/L時(shí)會(huì)生成沉淀，而且這種沉淀是逐步形成的；（3）乙腈不很穩(wěn)定，易與強(qiáng)酸反應(yīng)，如硫酸；（4）與醇類(lèi)溶劑相比，乙腈毒性較大，但在正常操作下，基本是安全的。第10頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

如經(jīng)試用不適合時(shí)，再選用其它溶劑系統(tǒng)。如在上述二元流動(dòng)相中加入少量的四氫呋喃，能夠改善某些難分離的物質(zhì)的分離度，還可加入少量有機(jī)堿類(lèi)（如三乙胺等）可改善色譜峰峰拖尾現(xiàn)象。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相，必須使用時(shí)，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動(dòng)相。另外，由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。第11頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月高壓輸液泵

高壓輸液泵是高效液相色譜儀中的關(guān)鍵部件之一。它將洗脫液在高壓下連續(xù)不斷地送入柱系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過(guò)程。在高效液相色譜儀中,對(duì)高壓輸液泵的性能有如下要求：

1.流量穩(wěn)定。為使色譜過(guò)程具有良好的重現(xiàn)性,泵的輸出流量要恒定。其流量精度為1%左右。

2.輸出壓力高。由于色譜柱填料顆粒細(xì),為使洗脫液以一定的流速流過(guò)色譜柱,泵必具有一定輸出壓力。不同的儀器，所使用的輸出壓力單位不同，最高的輸出壓力為500kg/cm2。另外,輸出壓力應(yīng)平衡,脈動(dòng)小,有利于降低檢檢測(cè)器的噪音,提高信噪比和柱效。第12頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月3.流量范圍寬。流量可調(diào)范圍大,一般在0.01～10ml/min范圍內(nèi)任選。

4.耐酸、堿緩沖液腐蝕。

5.泵體易于清洗。具有梯度洗脫功能，操作方便，容易維修。第13頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

目前在高效液相色譜儀中所采用的高壓輸液泵,按排液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵;按工作方式又可分為液壓隔膜泵、氣動(dòng)放大泵、螺旋注射泵和往復(fù)柱塞泵四種。前兩種為恒壓泵,后兩種為恒流泵。目前在高效液相色譜儀上采用最廣泛的為往復(fù)柱塞泵。第14頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

由驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)(馬達(dá)、減速器、驅(qū)動(dòng)凸輪)帶動(dòng)的小柱塞(φ3～4mm),在以密封環(huán)密封的液缸內(nèi)，以每分鐘數(shù)十次至一百多次的頻率作往復(fù)運(yùn)動(dòng)。當(dāng)小柱塞自液缸內(nèi)抽出時(shí),出口單向閥由于管路中液體的外壓力迫使它關(guān)死,液體自入口單向閥吸入液缸;當(dāng)小柱塞被推入時(shí),入口單向閥關(guān)死,液體經(jīng)壓縮自出口單向閥排出,如此周而復(fù)始,壓力逐漸上升。泵的輸出流量,可借柱塞往復(fù)運(yùn)動(dòng)的沖程或馬達(dá)的轉(zhuǎn)速來(lái)調(diào)節(jié)。由于泵的柱塞往復(fù)運(yùn)動(dòng)的頻率較高,所以對(duì)密封環(huán)的耐磨性及單向閥的剛度和精度要求很高。密封環(huán)一般采用聚四氟乙烯加添加劑材料制造,而單向閥的球、閥座及柱塞桿則用人造紅寶石材料。第15頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

往復(fù)柱塞泵因?yàn)樗囊焊兹莘e小,易于清洗和更換溶劑系統(tǒng),因此特別適合于梯度淋洗,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于高效液相色譜中。但由于泵體本身的結(jié)構(gòu),決定了它的輸出壓力是隨柱塞運(yùn)動(dòng)位置的變化而變化的,因此輸出壓力有明顯的起伏脈動(dòng)。為了克服此缺點(diǎn),目前儀器中使用的泵,大致用以下幾種方法減少它的壓力脈動(dòng)。①采用多頭泵(二頭或二頭以上)交替聯(lián)動(dòng)②壓力脈動(dòng)阻滯器③改進(jìn)驅(qū)動(dòng)凸輪的幾何形狀第16頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月梯度洗脫裝置

梯度洗脫,又稱(chēng)溶劑程序。在色譜分離過(guò)程中,洗脫液的組成按一定的速率連續(xù)改變,其作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫。由于液相色譜中洗脫液的極性變化直接影響樣品組分的保留值(或k’值),因此梯度洗脫可改善復(fù)雜樣品的分離度,縮短分析周期,改善峰形和提高樣品的最小檢測(cè)量。一般在液相色譜中,梯度洗脫比程序升溫、流速程序、重復(fù)分離和聯(lián)用柱等幾種方法有效得多。梯度洗脫裝置可分為以下兩類(lèi):第17頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月第18頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月1.低壓梯度洗脫裝置低壓梯度又稱(chēng)外梯度。它是一種在常壓下洗脫液按預(yù)先規(guī)定的比例混合后,再由高壓泵輸入色譜柱,所以也稱(chēng)為泵前混合。最簡(jiǎn)單的低壓梯度裝置。是利用兩個(gè)直角三角形容器,其幾何位置不同,兩種洗脫液的混合比例曲線也不同。由于其重復(fù)性差,現(xiàn)已很少采用。電磁比例閥的開(kāi)關(guān)頻率,由控制器控制。改變控制器程序,即可得到任意混合濃度的曲線。第19頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月2.高壓梯度洗脫裝置高壓梯度又稱(chēng)內(nèi)梯度。它是將溶劑經(jīng)高壓泵加壓后再混合的梯度洗脫裝置。常見(jiàn)的一種是由兩臺(tái)高壓泵、梯度程序控制器、混合器等部件組成。兩臺(tái)泵分別將兩種極性不同的溶劑輸入混合器,經(jīng)充分混合后進(jìn)入色譜柱。這是一種泵后高壓混合形式。高壓梯度所采用的泵,多為往復(fù)柱塞泵或螺旋泵。由此所獲得的流量精度高,梯度洗脫曲線重復(fù)性好。梯度洗脫的溶劑混合器應(yīng)具備容積小、無(wú)死區(qū)、清洗方便、混合效率高等性能，才能獲得重復(fù)的、滯后時(shí)間短的梯度洗脫曲線。第20頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月3.注意事項(xiàng)（1）溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差；（2）梯度混合的溶劑互溶性要好；（3）梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器（如紫外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器），而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測(cè)器（如示差折光檢測(cè)器）。第21頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣系統(tǒng)是將被分析試樣導(dǎo)入色譜柱的裝置。對(duì)于液相色譜的進(jìn)樣裝置，要求重復(fù)性好，死體積小，保證中心進(jìn)樣,進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜柱系統(tǒng)流量波動(dòng)要小，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等。進(jìn)樣系統(tǒng)包括取樣、進(jìn)樣兩個(gè)功能,而實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)功能又分手動(dòng)和自動(dòng)兩種方式。第22頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月柱溫箱

柱溫箱為放置色譜柱的地方，一般可以存放1～3根色譜柱。應(yīng)用柱溫箱可以保持色譜柱溫度，不受外界環(huán)境影響，主要表現(xiàn)為分析結(jié)果重現(xiàn)性好、提高柱效、降低柱壓、保證檢測(cè)穩(wěn)定性。較為先進(jìn)的柱溫箱不但可以保持較高溫度（80～100℃），也可以保持較低溫度（低于室溫10℃），同時(shí)可設(shè)置溫度程序控制。第23頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月色譜柱

色譜柱是高效液相色譜儀的核心部件，要求分離度高、柱容量大、分析速度快。要達(dá)到如此好的性能，不僅與固定相本身的性能有關(guān)，而且與色譜柱結(jié)構(gòu)、裝填和使用技術(shù)等有關(guān)。第24頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月色譜柱的使用及保養(yǎng)1.使用微徑柱時(shí)，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測(cè)池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對(duì)其測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生爭(zhēng)議時(shí)，應(yīng)以品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件的測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn)。

2.以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過(guò)40℃，為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱使用溫度，但不宜超過(guò)60℃。第25頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月檢測(cè)器

高效液相色譜法具有高效、高速、高靈敏度的特點(diǎn)。微量組分經(jīng)色譜柱分離后的檢測(cè)既不能用人的肉眼也不能分段取樣后用儀器檢測(cè)，只能采用檢測(cè)器在色譜柱后直接檢測(cè)。樣品組分洗脫液中的濃度或物理量變化，由檢測(cè)器連續(xù)地轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，在記錄儀上迅速地給出直觀的信息。操作者可按照所描繪的色譜峰位置來(lái)定量地判斷分離情況的優(yōu)劣,并根據(jù)峰面積定量地測(cè)定各組分的含量。第26頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

最常用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，包括二極管陣列檢測(cè)器、其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等。第27頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月餾分收集器

如果所進(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做了其他波譜鑒定,或獲得少量試驗(yàn)樣品的小型制備，餾分收集是必要的。用小試管收集、手工操作，只適合于少數(shù)幾個(gè)餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯(cuò)。餾分收集器比較理想，因?yàn)楸阌谟梦⑻幚頇C(jī)控制，按預(yù)先規(guī)定好的程序，或按時(shí)間，或按色譜峰的起落信號(hào)逐一收集和重復(fù)多次收集。第28頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月數(shù)據(jù)采集及處理

把檢測(cè)器的信號(hào)轉(zhuǎn)換為色譜圖，一般采用色譜積分儀及色譜工作站進(jìn)行。積分儀較為簡(jiǎn)單，可以設(shè)定積分參數(shù)，記錄保留時(shí)間、峰號(hào)以及峰面積，但是分離度和理論板數(shù)需手工計(jì)算，偏差較大；積分儀可儲(chǔ)存少量色譜圖，但關(guān)機(jī)后儲(chǔ)存的色譜圖即不再保存；積分儀記錄介質(zhì)多為熱敏紙，保存時(shí)間較長(zhǎng)后顏色消退，需另行復(fù)印后保存。第29頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

目前大部分高效液相色譜儀數(shù)據(jù)采集多用色譜工作站。較為簡(jiǎn)單的色譜工作站一般為國(guó)內(nèi)開(kāi)發(fā)，價(jià)格較為便宜，但只能進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，色譜條件只能由儀器設(shè)定。相對(duì)于積分儀來(lái)說(shuō)，由于使用計(jì)算機(jī)控制，色譜圖比較一目了然，改變積分參數(shù)后，可清晰看出色譜圖的變化；可以進(jìn)行分離度、理論板數(shù)等簡(jiǎn)單計(jì)算。第30頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月第三節(jié)檢測(cè)方法第31頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月紫外檢測(cè)法

紫外檢測(cè)法是高效液相色譜中最常用的檢測(cè)方法。由于有機(jī)化合物中近百分之八十都具有紫外吸收，因此紫外檢測(cè)器的應(yīng)用最早也最廣。這種檢測(cè)器具有很高的靈敏度，對(duì)環(huán)境溫度及流速波動(dòng)不甚敏感，適用于梯度洗脫操作。但是紫外檢測(cè)器一次只能得到一個(gè)波長(zhǎng)的色譜圖，而二極管陣列檢測(cè)器可以采集三維圖譜，針對(duì)每一個(gè)色譜峰可以進(jìn)行光譜掃描，進(jìn)行峰純度測(cè)定。第32頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月電化學(xué)檢測(cè)法

高效液相色譜中的電化學(xué)檢測(cè)法，是利用電化學(xué)固有的靈敏度對(duì)洗脫液中痕量電活性物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，既具有寬的線性動(dòng)力學(xué)測(cè)定范圍(106)及高的靈敏度(10-12g)，可與熒光檢測(cè)法相比，又可用于色譜行為相似而電化學(xué)性質(zhì)不同的化合物的測(cè)定，更具有專(zhuān)屬性。因此，在藥物分析中，高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法，主要應(yīng)用于復(fù)雜樣品中痕量組分的選擇測(cè)定，以及較復(fù)雜生物樣品中藥物及其代謝物的測(cè)定。第33頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月第五節(jié)色譜儀常見(jiàn)故障的分析和排除方法第34頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

在高效液相色譜的應(yīng)用中，故障主要出現(xiàn)在壓力異常、漏液、保留時(shí)間漂移、基線漂移及噪聲、峰形異常等幾個(gè)方面。故障的起因是多方面的，在儀器的每一環(huán)節(jié)都有可能出現(xiàn)化學(xué)或者機(jī)械上的問(wèn)題。而準(zhǔn)確地分析故障的原因所在和及時(shí)地排除故障，除專(zhuān)業(yè)維修人員外，對(duì)實(shí)驗(yàn)者來(lái)說(shuō)也是應(yīng)當(dāng)了解的。下面就以上五個(gè)方面的故障進(jìn)行分析，簡(jiǎn)單的故障可自己動(dòng)手排除。第35頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月壓力異常

（一）無(wú)壓力表現(xiàn)為無(wú)壓力，流動(dòng)相不流動(dòng)。電源問(wèn)題柱塞桿折斷泵頭內(nèi)有空氣或流動(dòng)相不足單向閥損壞漏液壓力傳感器損壞（流動(dòng)相流動(dòng)正常，但無(wú)壓力）。第36頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月（二）壓力持續(xù)偏高或不斷上升流速設(shè)定過(guò)高保護(hù)柱或色譜柱篩板堵塞流動(dòng)相使用不當(dāng)或有緩沖鹽析出色譜柱選擇不當(dāng)進(jìn)樣閥損壞線路過(guò)濾器堵塞第37頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月（三）壓力持續(xù)偏低流速設(shè)定過(guò)低色譜柱選擇不當(dāng)柱溫過(guò)高系統(tǒng)漏液第38頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

（四）壓力波動(dòng)泵頭中有氣泡單向閥損壞柱塞密封圈損壞脫氣不充分系統(tǒng)漏液使用了梯度洗脫第39頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月漏液（一）接頭處漏液接頭處松動(dòng)接頭磨損接頭被污染部件不匹配第40頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月（二）泵漏液?jiǎn)蜗蜷y松動(dòng)泵密封損壞瀉液閥損壞接頭松動(dòng)第41頁(yè),共50頁(yè)，星期六，2024年，5月

（三）進(jìn)樣閥漏液轉(zhuǎn)子密封損壞定量環(huán)堵塞進(jìn)樣口密封松動(dòng)進(jìn)樣針尺