分子生物學(xué)-背誦版

名詞解析原位PCR(insituPCR):直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在完整細(xì)胞中進(jìn)行PCR抗增的方法。實時定量PCR(qPCR):在反應(yīng)中引入了熒光標(biāo)記分子，在反應(yīng)過程中對反應(yīng)過程中每一時刻的產(chǎn)物量進(jìn)行實時分析。3、易錯PCR(error-pronePCR):通過改變PCR條件，提高擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基錯配率，從而獲得與原來不同的DNA序列或基因。4、分子信標(biāo)：是一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)靠近。5、熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))。如果檢測到熒光信號超過閾值則被認(rèn)為是真正的信號。熒光閾值通常設(shè)置為3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍。6、Ct值（循環(huán)閾值）：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號)到達(dá)閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。Ct值與模板起始拷貝數(shù)（起始模板量）的對數(shù)呈線性關(guān)系，模板起始拷貝數(shù)越大，Ct值越小。7、限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，又稱為內(nèi)切酶或限制酶。8、限制性核酸內(nèi)切酶的星號活性：限制酶在一些特定條件下使用時，對于底物DNA的特異性可能降低。即可以把與原來識別的特定的DNA序列不同的堿基序列切斷。9、質(zhì)粒（plasmid）:是存在于細(xì)菌染色質(zhì)以外，具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA。10、藍(lán)白斑篩選：是重組子篩選的一種方法，是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，主要為α-互補(bǔ)與抗生素基因。藍(lán)白斑篩選在指示培養(yǎng)基上，未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的菌落因無抗生素抗性而不能生長，重組質(zhì)粒的菌落是白色的，非重組質(zhì)粒的菌落是藍(lán)色的，以顏色不同為依據(jù)直接篩選重組克隆的方法。11、轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒DNA或以質(zhì)粒載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞細(xì)菌(大腸埃希菌)的過程。12、包含體：是無定型的蛋白質(zhì)聚合物，其中大部分（50%以上）是外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，這些產(chǎn)物一級結(jié)構(gòu)正確，但空間構(gòu)像錯誤。13、印跡：指利用各種物理方法，使電泳凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜等特定的支持物上，使之成為固相化分子的過程。14、核酸分子雜交：指含有一部分互補(bǔ)序列、分子來源不同的核苷酸單鏈，在一定條件下按照堿基互補(bǔ)配對的原則，形成核苷酸雙鏈的過程。15、核酸探針（probe）：用來檢測某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的標(biāo)記互補(bǔ)片段。16、熒光原位雜交（FISH）：是直接用熒光標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞涂片中的目標(biāo)基因進(jìn)行雜交的方法?？捎糜跈z測組織切片或細(xì)胞內(nèi)某些特異性核苷酸或核酸片段。17、隨機(jī)引物：含有各種可能排列順序的6聚寡核苷酸片段的混合物。18、receptor(受體）：位于細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的能特異識別和結(jié)合信息分子，并轉(zhuǎn)導(dǎo)信號引起生物學(xué)效應(yīng)的一類生物大分子。19、ligand(配體）：與受體特異結(jié)合的生物活性分子。20、hormone（激素）：指體內(nèi)的某一細(xì)胞、腺體或者器官所產(chǎn)生的可以影響機(jī)體內(nèi)其他細(xì)胞活動的化學(xué)物質(zhì)。21、growthfactor（生長因子）：是能夠刺激細(xì)胞生長、增殖、愈合和細(xì)胞分化的天然存在的物質(zhì)。22、signalmolecule(信號分子）：具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動的化學(xué)物質(zhì)。23、cellcommunication（細(xì)胞通訊）：體內(nèi)一些細(xì)胞發(fā)出信號，另一些細(xì)胞接收信號并將其轉(zhuǎn)變?yōu)樽陨砉δ茏兓倪^程。24、signaltransduction（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)）：細(xì)胞針對外源信息所發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)變化及效應(yīng)的全過程。25、extracellularsignalmolecules(細(xì)胞間信息物質(zhì)):是由細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生命活動的化學(xué)物質(zhì)的統(tǒng)稱，又稱作第一信使。26、intracellularsignalmolecules(細(xì)胞內(nèi)信息物質(zhì)):在細(xì)胞內(nèi)傳遞細(xì)胞調(diào)控信號的化學(xué)物質(zhì)。27、secondmessenger(第二信使):激素等配體作用于膜受體后，在胞內(nèi)傳遞信息的信號分子。簡答題1、多肽與蛋白質(zhì)的區(qū)別與聯(lián)系。答：區(qū)別：⑴在結(jié)構(gòu)上：多肽指的是多個氨基酸脫水縮合形成的線性氨基酸鏈，僅僅是蛋白質(zhì)的初級結(jié)構(gòu)形式，它沒有空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)是由\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8/_blank"氨基酸以\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8/_blank"脫水縮合的方式組成的多\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8/_blank"肽鏈經(jīng)過盤曲折疊形成的物質(zhì)，具有一定空間結(jié)構(gòu)的。⑵在功能上：多肽分子量較小，不一定具有生物學(xué)活性。蛋白質(zhì)的分子量較大，一般都具有生物學(xué)活性。聯(lián)系：氨基酸是組成多肽和蛋白質(zhì)的基本單位，所以多肽和蛋白質(zhì)都能水解成氨基酸。蛋白質(zhì)是由一條或幾條多肽經(jīng)過加工變形得到的具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的大分子。2、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)如何影響其功能。答：⑴蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)，也是功能的基礎(chǔ)。一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的高級結(jié)構(gòu)與功能，若一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變影響其功能，稱分子病。⑵蛋白質(zhì)空間構(gòu)象與功能有密切關(guān)系。生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、加工和成熟是一個復(fù)雜的過程，其中多肽鏈的正確折疊對其正確構(gòu)象的形成和功能的發(fā)揮至關(guān)重要。若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病的發(fā)生，稱為蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病。3、凝膠過濾層析的原理。答：是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。當(dāng)含有分子量不同的蛋白質(zhì)樣品加到凝膠柱上時，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質(zhì)就要連續(xù)不斷地穿入凝膠珠的內(nèi)部，這樣的小分子不但其運動路程長，而且受到來自凝膠珠內(nèi)部的阻力也很大，所以分子量越小的蛋白質(zhì)，從柱子上洗脫下來所花費的時間越長。凝膠中只有很少的孔徑可接受大分子蛋白質(zhì)，所以分子量大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來。4、PCR過程中的DNA模板變性、模板與引物退火、引物延伸3步的溫度設(shè)置一般大致是多少？設(shè)置的主要依據(jù)是什么？答：(1)DNA模板熱變性(denature)：94℃左右高溫使模板DNA完全變性。(2)單鏈DNA模板與引物退火(annealing)：55℃左右引物與模板形成復(fù)合物的幾率>>DNA分子自身的復(fù)性。(3)引物的延伸(extension)：72℃左右耐熱DNA聚合酶在最適溫度下催化DNA合成反應(yīng)。5、衡量PCR好壞的參數(shù)主要有哪些？一般來說好的結(jié)果如何體現(xiàn)？答：(1)特異性Specificity:最好只有目的DNA帶。(2)產(chǎn)量Quantity:DNA帶明亮。(3)真實性Fidelity:DNA序列正確。(4)敏感性Sensitivity：極限值為1個DNA模板。6、以TaqMan技術(shù)和SYBRGreenI技術(shù)為例，簡述實時熒光PCR的原理。答：（1）技術(shù)原理：①TaqMan技術(shù)：加入TaqMan探針，PCR擴(kuò)增時,Taq酶的5’→3’端外切酶活性將探針酶切降解，使探針上的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，使熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下發(fā)出熒光；每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。②SYBRGreenI技術(shù)：SYBRGreenI是能與雙鏈DNA非特異性結(jié)合并發(fā)出熒光的一種染料，通過PCR反應(yīng)生成雙鏈DNA，SYBRGreenI與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光，通過檢測熒光不但可以檢測反應(yīng)體系中的DNA擴(kuò)增量，同時還能測定擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA融解溫度。（2）定量原理：①絕對定量：利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過測定未知樣品的Ct值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始濃度。②相對定量：a、選擇內(nèi)參照基因：選擇GAPDH、β-actin等看家基因作為內(nèi)參照基因，其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量恒定，受環(huán)境因素的影響小，其結(jié)果代表了加入樣品的量。b、計算相對表達(dá)量(△△Ct)=(Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因)實驗組－(Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因)對照組。C、計算相對表達(dá)比率(2－△△Ct)，通過公式2－△△Ct計算相對表達(dá)比率；表示實驗組目的基因的表達(dá)量相對于對照組目的基因表達(dá)量的倍數(shù)。7、簡述DNA重組技術(shù)的基本步驟。答：(1)分：獲取目的基因并進(jìn)行必要的改造。(2)切：選擇載體并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割。(3)接：將目的基因與載體連接成重組DNA。(4)轉(zhuǎn)：將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。(5)篩：含重組DNA宿主細(xì)胞的克隆化及鑒定。8、簡述獲取目的基因的4種主要途徑。答：（1）酶切法直接分離目的DNA片段：①從載體上切割DNA片段。②構(gòu)建基因組文庫。（2）PCR和RT-PCR技術(shù)體外擴(kuò)增合成目的DNA片段。（3）篩選文庫獲得目的DNA片段。（4）化學(xué)合成-PCR搭接法獲得目的DNA片段。9、簡述大腸埃希菌表達(dá)載體及其表達(dá)方式。答：（1）非融合表達(dá)載體：僅表達(dá)目的基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽。（2）融合表達(dá)載體：表達(dá)融合基因(目的基因+附加基因)編碼的蛋白質(zhì)或多肽。（3）分泌表達(dá)載體：加入了信號肽編碼序列。（4）表面展示表達(dá)載體：噬菌體表面展示技術(shù)、細(xì)菌表面表達(dá)技術(shù)。（5）帶分子伴侶的表達(dá)載體：促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊。10、簡述真核表達(dá)載體中含有哪些的原核和真核的重要序列。答：（1）真核表達(dá)質(zhì)粒載體，一般由兩部分組成，一部分（用于原核細(xì)胞）來源于pUC質(zhì)粒，包括復(fù)制起始點OriC和ampr基因，用于在原核細(xì)胞中復(fù)制及篩選；另一部分（用于真核細(xì)胞）來源于病毒，包括PCMV（巨細(xì)胞病毒啟動子）、新霉素抗性基因(neo)及polyA加尾信號序列，用于在真核細(xì)胞中復(fù)制、篩選及表達(dá)。11、核酸探針標(biāo)記的主要方法有哪些？簡述DNA切口平移標(biāo)記法、隨機(jī)引物標(biāo)記法和3′末端標(biāo)記的基本原理？答：主要方法有：DNA切口平移標(biāo)記法、DNA隨機(jī)引物標(biāo)記法、3′DNA末端標(biāo)記法。(1)DNA切口平移標(biāo)記法：當(dāng)雙鏈DNA一條鏈上有切口時，E.coliDNA聚合酶Ⅰ的5’→3’的外切酶活性能從切口的5’端除去核苷酸；同時，5’→3’聚合酶活性可將核苷酸連接到切口的3’羥基末端；使切口沿著DNA鏈移動。用一種標(biāo)記核苷酸代替原料dNTPs中對應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸，使標(biāo)記核苷酸摻入到合成新鏈中。（2）DNA隨機(jī)引物標(biāo)記法：使寡核苷酸隨機(jī)引物與DNA模板結(jié)合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針；用一種標(biāo)記核苷酸代替原料核苷酸中對應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸，使標(biāo)記核苷酸摻入到合成新鏈中。（3）3′DNA末端標(biāo)記法：用一種標(biāo)記核苷酸代替原料核苷酸中對應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸，使標(biāo)記核苷酸摻入到合成新鏈中。12、簡述采用Biotin標(biāo)記探針進(jìn)行North-South雜交原理和操作流程。答：原理：首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過與特定基因互補(bǔ)配對的Biotin標(biāo)記探針雜交來檢測目的片段。流程：（1）電泳，轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)固定。（2）洗膜封閉。（3）雜交：生物素標(biāo)記的探針與靶DNA結(jié)合。（4）HRP標(biāo)記的鏈親和素與探針上的生物素結(jié)合。（5）底物在HRP催化下，反應(yīng)發(fā)光。13、列表對照下列蛋白激酶的中文名、激活劑及功能：PKA,PKC,PKG,PKB,MAPK,PTK(TPK)。答：PKA(蛋白激酶A)：被cAMP激活，催化多種蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸磷酸化。PKC(蛋白激酶C):多種同工酶受二酰甘油(DAG)、Ca2+、磷脂酰絲氨酸（PS）的激活，絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞多項生理活動。PKG(蛋白激酶G):被cGMP激活，絲/蘇氨酸蛋白激酶。PKB(蛋白激酶B):可被PIP3、PDK激活，絲/蘇氨酸蛋白激酶，與細(xì)胞代謝、凋亡、癌變有關(guān)。MAPK(絲裂原激活蛋白激酶):被MAPKK激活，MAPK是多條信號通路的交匯點,與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡有關(guān)。PTK(TPK)，蛋白酪氨酸激酶（酪氨酸蛋白激酶）:被許多生長因子受體或src、abl、FAK等激活，與細(xì)胞生長、增殖、分化、癌變等有關(guān)。14、比較幾種膜受體的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理和相應(yīng)配體。答：⑴G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理：受體內(nèi)有一些高度保守的半胱氨酸殘基，對維持受體的結(jié)構(gòu)起到關(guān)鍵作用。受體的N端可有不同的糖基化，C端的半胱氨酸在腎上腺素能α、β受體(α-AR,β-AR)和視紫質(zhì)受體中可被棕櫚?；Ｊ荏w的C-末端和胞內(nèi)第三環(huán)含有多個Thr和Ser殘基可被磷酸化。胞內(nèi)的第二和第三個環(huán)能與G-蛋白相偶聯(lián)。相應(yīng)配體：激素和神經(jīng)遞質(zhì)。（2）單（個）跨膜α螺旋受體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理：與配體結(jié)合即具有酪氨酸蛋白激酶活性，可催化自身或其他底物蛋白磷酸化。相應(yīng)配體：許多生長因子(EGF、PDGF、IGF-1)。（3）鳥苷酸環(huán)化酶活性受體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理：胞外受體結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)域、膜內(nèi)蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域、鳥苷酸環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域。相應(yīng)配體：心鈉肽（ANP）和鳥苷蛋白等。（4）配體門控離子通道受體（分為陰離子通道受體、陽離子通道受體、）15、G蛋白循環(huán)（分析G蛋白的活化、非活化狀態(tài)）答：⑴G蛋白的活化狀態(tài)：當(dāng)G蛋白的α亞基與GTP結(jié)合時，并且α亞基與β、γ亞基分離，G蛋白此時處于活化狀態(tài)。⑵G蛋白的非活化狀態(tài)：當(dāng)G蛋白發(fā)揮水解酶的活性后，將GTP變成GDP并釋放Pi，重新形成三聚體結(jié)構(gòu)，此時G蛋白又變成非活化狀態(tài)。16、請用所學(xué)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)知識簡述霍亂的發(fā)病機(jī)制（生化機(jī)制）PS：附橋本病、Graves病。答：霍亂是由霍亂弧菌導(dǎo)致的，霍亂弧菌產(chǎn)生霍亂毒素（CT），CT由A亞基和B亞基組成。其中A亞基具有酶活性，它能催化小腸粘膜上皮細(xì)胞上的Gs蛋白α亞基與NAD+反應(yīng)，生成ADP-核糖化的G蛋白α亞基,從而維持G蛋白α亞基活性狀態(tài)，然后AC被激活，繼而活化cAMP,最后激活PKA，它具有