HYT 153-2013 海水、沉積物中致突變性的測(cè)定 鼠傷寒沙門(mén)氏菌哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（正式版）

海水、沉積物中致突變性的測(cè)定鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)typhimurium/mammalsmicrosomal2013-04-25發(fā)布I Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14方法原理 15儀器設(shè)備 16試劑和材料 27菌株選擇、鑒定和保存 28樣品采集和保存 39分析步驟 410結(jié)果判定 511結(jié)果計(jì)算 5附錄A(規(guī)范性附錄)菌株生物學(xué)特性鑒定標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)準(zhǔn)診斷性誘變劑 6參考文獻(xiàn) 8表A.1菌株生物學(xué)特性鑒定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果 6表A.2標(biāo)準(zhǔn)誘變劑測(cè)定結(jié)果及表示方法 6表A.3推薦用標(biāo)準(zhǔn)誘變劑 7Ⅲ本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC283)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：國(guó)家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、國(guó)家海洋局東海標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量中心。1海水、沉積物中致突變性的測(cè)定鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海水和沉積物中致突變性測(cè)定所需的樣品采集、處理、試驗(yàn)、分析、計(jì)算等的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于海水和沉積物的致突變性的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB15193.4—2003鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)GB17378.5海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第5部分：沉積物分析3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件?；貜?fù)突變r(jià)eversemutation細(xì)菌在化學(xué)突變物作用下由營(yíng)養(yǎng)缺陷型回變到野生型。鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)Salmonellatyphimuriumreversemutationtest利用一組鼠傷寒沙門(mén)氏組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起沙門(mén)氏菌堿基對(duì)置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型回復(fù)突變到野生型的試驗(yàn)方法。4方法原理人工誘變鼠傷寒沙門(mén)氏菌的突變型(即組氨酸缺陷型)菌株在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，在有組氨酸的培養(yǎng)基上可以正常生長(zhǎng)。但如在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基中有致突變物存在時(shí)，則沙門(mén)氏菌突變型可回復(fù)突變?yōu)橐吧?表現(xiàn)型),因而在無(wú)組氨酸培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)，故可根據(jù)菌落形成數(shù)量，檢查受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能使沙門(mén)氏菌突變型產(chǎn)生回復(fù)突變，代謝活化系統(tǒng)可以用多氯聯(lián)苯(PCB)誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿(S-9)制備的S-9混合液。使用鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)檢測(cè)海水或沉積物的致突變性。5儀器設(shè)備本試驗(yàn)應(yīng)包括以下儀器設(shè)備：2a)低溫高速離心機(jī)：溫度4℃,轉(zhuǎn)速12000r/min;b)超低溫冰箱：-80℃,或液氮罐；c)潔凈工作臺(tái)；d)恒溫震蕩培養(yǎng)箱：37℃±1℃;f)蒸汽壓力鍋：121℃±1℃;g)K-D濃縮器；D采泥器；m)培養(yǎng)皿：直徑90mm;n)其他實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。6試劑和材料營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、底層培養(yǎng)基、頂層培養(yǎng)基、0.8%氨芐青霉素溶液、0.1%結(jié)晶紫溶液、L-組氨酸溶液、0.5mmol/LD-生物素溶液、0.8%四環(huán)青霉素-四環(huán)素平板培養(yǎng)基、組氨酸-生物素平板培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)(光譜純)、S-9輔助因子(混合液試劑)、10%S-9混合液、活化系統(tǒng)(S-9或S-9混合液)的制備按GB15193.4—2003中第4章的要求執(zhí)行。除非另作說(shuō)明，所用試劑均為分析純，培養(yǎng)基成分無(wú)誘變性，水為蒸餾水或等效純水。所用試劑應(yīng)避免高溫處理。采用兩株鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變型菌株TA98、TA100。TA98可檢測(cè)各種移碼型誘變劑；TA100可檢測(cè)引起堿基對(duì)置換的誘變劑。7.2菌株鑒定7.2.1菌株鑒定要求菌株特性應(yīng)與鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)相符(見(jiàn)附錄A中表A.1)。突變型菌的某些特性易丟失或變異，遇到下列情況應(yīng)鑒定菌株的基因型：a)在收到培養(yǎng)菌株后；b)當(dāng)制備一套新的冷凍保存株或冰凍干燥菌株時(shí)；c)當(dāng)每皿自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)超出表A.1所規(guī)定的正常范圍時(shí)；d)當(dāng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誘變劑喪失敏感性時(shí)；e)使用主平板傳代時(shí)；f)投入使用前。37.2.2菌株鑒定方法7.2.2.1增菌培養(yǎng)將菌種接種于10mL已滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)14h～16h,每毫升活菌數(shù)不少于1×10?個(gè)，培養(yǎng)瓶避光培養(yǎng)。7.2.2.2組氨酸缺陷型的鑒定組氨酸缺陷型的鑒定按GB15193.4—2003中5.2.2的要求執(zhí)行。7.2.2.3脂多糖屏障缺陷的鑒定脂多糖屏障缺陷的鑒定按GB15193.4—2003中5.2.3的要求執(zhí)行。7.2.2.4R因子的鑒定R因子的鑒定按GB15193.4—2003中5.2.4的要求執(zhí)行。7.2.2.5四環(huán)素抗性的鑒定四環(huán)素抗性的鑒定按GB15193.4—2003中5.2.5的要求執(zhí)行。7.2.2.6uvrB修復(fù)缺陷型的鑒定uvrB修復(fù)缺陷型的鑒定按GB15193.4—2003中5.2.6的要求執(zhí)行。7.2.2.7自發(fā)回復(fù)突變率的測(cè)定自發(fā)回復(fù)突變率測(cè)定按GB15193.4—2003中5.2.7的要求執(zhí)行。7.2.2.8陽(yáng)性對(duì)照7.2.2.8.1制備底層培養(yǎng)基平皿。7.2.2.8.2在2mL無(wú)菌頂層培養(yǎng)基中加入0.1mL增菌液和0.1mL陽(yáng)性物(標(biāo)準(zhǔn)誘變劑測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表A.2,推薦用標(biāo)準(zhǔn)誘變劑見(jiàn)表A.3),一式三份，搖勻，迅速將此管內(nèi)容物倒入底層培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使頂層培養(yǎng)基均勻分布，平放固化，37℃培養(yǎng)48h。7.2.2.8.3結(jié)果判定：出現(xiàn)密集菌落(不小于2倍以上自發(fā)回復(fù)突變數(shù))者為突變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性。7.3菌株保存鑒定合格的菌株應(yīng)直接超低溫(-60℃~?80℃)保存或在10mL增菌液中加入1.0mL二甲基亞砜后超低溫(-60℃~一80℃)保存，保存期限一般不超過(guò)2年。8樣品采集和保存8.1水樣采集與保存采集前用待采集的水樣蕩洗密閉容器2次～3次，水樣采集不少于25L,避免陽(yáng)光直射，采集時(shí)應(yīng)注意密閉容器中不留空隙，運(yùn)輸時(shí)避免劇烈晃動(dòng)，常溫保存時(shí)間不超過(guò)14d。8.2沉積物采集與保存沉積物采用采泥器采集，樣品量不少于1000g,沉積物樣品保存在惰性容器中，避光冷凍保存4(-20℃±1℃),保存時(shí)間不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月。9分析步驟9.1水樣濃縮液制備9.1.1樹(shù)脂處理9.1.1.1按質(zhì)量比7:3稱(chēng)取XAD-2、XAD-7樹(shù)脂，混合后用重蒸餾水洗去所含氯化物，去除浮于上層的樹(shù)脂，用甲醇將水去除。9.1.1.2樹(shù)脂應(yīng)依次用丙酮、乙醚、甲醇各蒸餾回流8h,并最終保存在甲醇中。9.1.2層析柱安裝按體積比1:10配制稀鹽酸，并將玻璃棉用稀鹽酸浸泡24h后用蒸餾水清洗2次～3次，再經(jīng)丙酮、乙醚、甲醇各蒸餾回流8h。處理后的樹(shù)脂倒入一支高70cm、直徑3cm的層析柱內(nèi)，樹(shù)脂體積120mL～150mL。在層析柱底部及樹(shù)脂柱上部放入經(jīng)處理過(guò)的玻璃棉以支撐樹(shù)脂并截留雜質(zhì)，用1000mL蒸餾水沖洗層析柱。9.1.3水樣吸附和過(guò)濾用虹吸法將25L水樣以40mL/min流速通過(guò)層析柱。9.1.4鹽分去除用1000mL蒸餾水沖洗，以40mL/min的流速通過(guò)層析柱。9.1.5有機(jī)物洗脫水樣過(guò)柱吸附后用氮?dú)獯蹈蓪游鲋?，?00mL色譜純丙酮[視情況亦可用丙酮：甲醇(體積比)=3:7的混合溶劑]分3次，以3mL/min流速收集洗脫液于三角燒瓶。9.1.6有機(jī)物濃縮用過(guò)量無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾脫水后，倒入K-D濃縮器濃縮至2mL左右，于40℃水浴條件下用平穩(wěn)氮?dú)饬鲗饪s的提取液吹干，并用二甲基亞砜定容至2.5mL。9.1.7濃縮有機(jī)物保存定容后有機(jī)物樣品置于4℃避光保存。9.2沉積物中濃縮有機(jī)物制備9.2.1樣品預(yù)處理將樣品風(fēng)干、研磨后，經(jīng)孔徑為250μm～420μm的篩子過(guò)篩，采用四分法逐級(jí)縮分，直至選取大于400g的樣品為止，常溫避光保存。留取2份樣品各100g,其中一份用于測(cè)定含水率。含水率的測(cè)定按GB17378.5的要求執(zhí)行。9.2.2提取方法9.2.2.1索氏提取將100g沉積物樣，放入索氏提取器，用300mL二氯甲烷在溶劑沸點(diǎn)條件下提取16h,使提取液冷5將100g沉積物樣品放入研磨罐中，加入150mL二氯甲烷至少研磨30min,提取2次，9.2.4溶劑置換濃縮后有機(jī)物樣品置于4℃避光保存。a)取底層培養(yǎng)基20mL,制備底層平皿42個(gè)；b)加入2mL融化的頂層培養(yǎng)基分裝于無(wú)菌小試管中，在45℃水浴中保溫；c)在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入測(cè)試菌株新鮮增菌液0.1mL,混勻；按3個(gè)濃度梯度加入受不加測(cè)試物只加0.1mL二甲基亞砜，其他方法按9.3中的a)～d)執(zhí)行；f)做完試驗(yàn)后一切帶菌的器皿、培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)經(jīng)121℃高壓滅菌20min。對(duì)待測(cè)物的每個(gè)劑量及陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)列出每皿的實(shí)際回復(fù)突變菌落數(shù)及平均數(shù)，其中3個(gè)平行樣回復(fù)突變菌落數(shù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于30%。 (1)6(規(guī)范性附錄)菌株生物學(xué)特性鑒定標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)準(zhǔn)診斷性誘變劑表A.1至表A.3分別給出了菌株生物學(xué)特性鑒定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)誘變劑測(cè)定結(jié)果及表示方法以及推薦用標(biāo)準(zhǔn)誘變劑。表A.1菌株生物學(xué)特性鑒定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果自發(fā)回復(fù)突組氨酸缺陷脂多糖屏障缺陷(抗氨芐青霉素)十+十十十十十十注：組氨酸缺陷：“+”表示需要組氨酸；脂多糖屏障缺陷：“+”表示抑制帶；R因子(抗氨芐青霉素有R因子；抗四環(huán)素：“一”表示無(wú)四環(huán)素抗性；uvrB修復(fù)缺陷：“+”表示表A.2標(biāo)準(zhǔn)誘變劑測(cè)定結(jié)果及表示方法疊氮鈉32,4,7-三硝基芴酮 甲基磺酸甲酯2-乙酰氨基芴十十注：所列數(shù)值代表his+回復(fù)突變菌落數(shù)值，取自劑量反應(yīng)的線性部分，對(duì)照值已扣除，用PCB0.005μg在TA100引起的回復(fù)突變菌落數(shù)小于70;絲裂霉素對(duì)uvrB菌株是致命的。7疊氮鈉十2-乙酰氨基芴2-乙酰氨基芴8[1]GB/T15440—1995環(huán)境中有機(jī)污染物遺傳毒性檢測(cè)的樣品前處理規(guī)范[2]鄔建勇，王金輝，秦玉濤等.長(zhǎng)江口表層水體的生態(tài)遺傳毒性初步研究[J].海洋與湖沼，2006,37(1):20-27.[3]鄔建勇，黃秀清，王金輝等.遺傳毒性檢測(cè)技術(shù)在海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2004,23(1):77-80.[4]UmbuzeiroGdeA,KummrowF,RoubicekgenotoxicityfromSantosEstuary(Brazil)inrelationtodischarges[J].Environment