GB/T 43450-2023 化學(xué)品 急性眼刺激體外細(xì)胞試驗(yàn) TRPV1活性檢測(cè)法（正式版）

化學(xué)品急性眼刺激體外細(xì)胞試驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T43450—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)危險(xiǎn)化學(xué)品管理標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC251)提出并歸口。本文件起草單位：南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院(南京市質(zhì)量發(fā)展與先進(jìn)技術(shù)應(yīng)用研究院)、中國(guó)藥科大學(xué)、中國(guó)化工經(jīng)濟(jì)技術(shù)發(fā)展中心、中檢科健(天津)檢驗(yàn)檢測(cè)有限責(zé)任公司、廈門豐力揚(yáng)科技有限公司、浙江輝日環(huán)境檢測(cè)有限公司。1GB/T43450—2023化學(xué)品急性眼刺激體外細(xì)胞試驗(yàn)TRPV1活性檢測(cè)法1范圍本文件規(guī)定了化學(xué)品急性眼刺激試驗(yàn)的方法原理、儀器與試劑耗材、試驗(yàn)和結(jié)果判定。本文件適用于化學(xué)品急性眼刺激性的體外檢測(cè)，化學(xué)品溶于水且受試溶液的pH應(yīng)在6.5～7.8范2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T21609化學(xué)品急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)方法SN/T2285化妝品體外替代試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)范SN/T3899化妝品體外替代試驗(yàn)良好細(xì)胞培養(yǎng)和樣品制備規(guī)范3.1術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1.1眼球表面接觸受試物后產(chǎn)生的眼睛可逆性炎性變化。3.1.2激動(dòng)劑agonist既有親和力又有內(nèi)在活性，能與受體結(jié)合并激動(dòng)受體產(chǎn)生效應(yīng)的化合物。3.1.3與受體結(jié)合后本身不引起生物學(xué)效應(yīng)，但能阻斷該受體產(chǎn)生激動(dòng)效應(yīng)的化合物。3.2縮略語下列縮略語適用于本文件。AUC:曲線下面積(AreaUnderCurve)BSA:牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin)DMEM:杜氏改良依格爾培養(yǎng)基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)2GB/T43450—2023DMSO:二甲基亞砜(DimethylSulfoxide)EDTA:乙二胺四乙酸(EthylenedinitrilotetraaceticAcid)FBS:胎牛血清(FetalBovineSerum)HBSS:Hank's平衡鹽溶液(Hank'sBalancedSaltSolution)PBS:磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferedSaline)TRPV1:瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1基因(TransientReceptorPotentialVanilloidType-1)TRPV1-HEK293:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人源TRPV1的人胚胎腎293細(xì)胞系(HumanTransientReceptorPo-tentialVanilloidType-1StableTransfectedHEK293CellLine)具有眼刺激性的化學(xué)品可通過激活TRPV1通道引起鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高。通過測(cè)試化學(xué)品作用于TRPV1-HEK293細(xì)胞后的胞內(nèi)鈣離子濃度的改變，反映TRPV1通道的實(shí)時(shí)5儀器與試劑耗材5.1.2二氧化碳培養(yǎng)箱：溫度為37℃±1℃,二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%±1%,相對(duì)濕度為90%±5%。5.1.4倒置顯微鏡。5.1.7細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)器。5.1.8離心機(jī)。最大允許系統(tǒng)誤差為5%。5.1.12超低溫冰箱。5.2試劑耗材5.2.2TRPV1-HEK293細(xì)胞系。用0.22μm的濾膜過濾除菌，儲(chǔ)存于4℃不超過1個(gè)月。5.2.4完全培養(yǎng)基：常規(guī)培養(yǎng)時(shí)，完全培養(yǎng)基配方為90%DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1mg/mL遺傳霉素(CAS:108321-42-2)。試驗(yàn)時(shí)，完全培養(yǎng)基配方為90%pH至7.2,用雙蒸水定容至1000mL,115℃高壓滅菌15min,儲(chǔ)存于4℃不超過1個(gè)月。5.2.60.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA:稱取0.05g胰蛋白酶干粉和0.02gEDTA,先加入少量PBS溶3GB/T43450—2023液，4℃低速攪拌，完全溶解后調(diào)節(jié)pH至7.2,用PBS溶液定容至100mL,過濾除菌，儲(chǔ)存于-20℃,使用前于37℃預(yù)熱。0.06gNa?HPO?·2H?O、0.06gKH?PO?、1.0g葡萄糖、0.14gCaCl?、0.35gNaHCO?蒸水充分混勻，調(diào)pH至7.2,用雙蒸水定容至1000mL,儲(chǔ)存于4℃不超過1個(gè)月。5.2.8HBSS緩沖液：稱取HEPES(CAS:7365-45-9)2.383g,加入Hank's平衡鹽溶液定容至500mL,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.9辣椒素(Capsaicin)溶液：TRPV1激動(dòng)劑(CAS:404-86-4)。稱取1mg辣椒素溶于3.274mLDMSO中，配制成1mmol/L的母液，-20℃分裝保存。使用前取3μL母液，加372pLHBSS緩沖5.2.10辣椒平(Capsazepine)溶液：TRPV1拮抗劑(CAS:138977-28-3)。稱取5mg辣椒平溶于0.132mLDMSO中，配制成100mmol/L的母液，-20℃分裝保存。使用前取10μL母液，加10mL5.2.11鈣離子染料Fluo-4AM溶液：稱取1mgFluo-4AM(CAS:273221-67-3),溶于227.9μLDMSO中，配制成4mmol/L的母液，避光保存于-20℃,分裝保存。使用前取10μLFluo-4AM母液，加9mLHBSS緩沖液和1mL50mg/mLBSA(CAS:9048-46-8,HBSS緩沖液配制),37℃預(yù)熱，即用即配。5.2.120.22μm濾器。5.2.13無菌吸管：規(guī)格10mL。5.2.15細(xì)胞凍存管。5.2.1696孔黑色透明平底酶標(biāo)板(細(xì)胞板)。5.2.1796孔尖底透明酶標(biāo)板(加樣板)。6試驗(yàn)方法6.1基本要求細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的溶液和器皿等均應(yīng)無菌，并且所有操作都應(yīng)在無菌環(huán)境和Ⅱ級(jí)生物安全柜或超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。定期檢查細(xì)胞，確保無微生物污染。細(xì)胞由有資質(zhì)的細(xì)胞庫提供。細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存應(yīng)符合SN/T3899的要求，使用25代之內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)過程應(yīng)符合SN/T2285的要求。6.2試驗(yàn)步驟日常培養(yǎng)時(shí)，TRPV1-HEK293細(xì)胞使用常規(guī)培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基在37℃±1℃,二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%±1%,相對(duì)濕度為90%±5%條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行了2次～3次傳代，顯微鏡下觀察生長(zhǎng)狀況良好，培養(yǎng)液清澈透明無雜質(zhì)，細(xì)胞無懸浮或微量懸浮，貼壁均勻，胞漿內(nèi)顆粒少，則可進(jìn)行細(xì)胞接種。使用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次～4次，加入預(yù)熱至37℃的0.05%胰蛋白酶(含EDTA)溶液消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度以2×10?個(gè)/孔接種至細(xì)胞板的所有細(xì)胞孔，每孔150μL?？瞻讓?duì)照孔中不加液體。在細(xì)胞培養(yǎng)板的外周孔中加入200μL無菌雙蒸水，以減少培養(yǎng)基的蒸發(fā)(細(xì)胞板分布見圖1)。將細(xì)胞板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4ABCDEFGHGB/T43450—2023ABCDEFGHH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OH?OCell:細(xì)胞孔(每孔加入150pL細(xì)胞懸液。其中Cellngss為緩沖液對(duì)照孔，Cellec為陽性對(duì)照孔，Cellc-為受試樣品無BL:空白對(duì)照孔(不加液體)。吸取移除細(xì)胞板所有細(xì)胞孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入60μL鈣離子染料Fluo-4AM,于二氧化碳培養(yǎng)箱中6.2.4.1受試物可為實(shí)驗(yàn)純以上純度的單一化學(xué)品或若干化學(xué)品組成的混合物。對(duì)于液態(tài)受試樣測(cè)試受試物的溶解性，可選擇的溶劑包括HBSS、DMSO、PBS等孔60μL。每板可同時(shí)測(cè)試6個(gè)樣品(C1～C6)。緩沖液對(duì)照孔(HBSS)每孔加入60μLHBSS緩沖液。陽性對(duì)照孔(PC)每孔加入60μL辣椒素溶液(5.2.9)。溶劑對(duì)照孔(SC)每孔加入60μL含與受試樣品孔中相等體積溶劑的HBSS緩沖液(以溶劑為DMSO為例，取3pLDMSO加入372μLHBSS緩沖5GB/T43450—2023ABCDEFGHHBSSHBSSHBSSHBSSHBSSHBSS圖2加樣板分布圖6.2.5.1分別將細(xì)胞板和加樣板放置于高通量實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)的相應(yīng)位置，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)范圍6.2.5.2測(cè)試開始后，先不加樣品，連續(xù)檢測(cè)細(xì)胞板的基線熒光強(qiáng)度60s,以最初10個(gè)時(shí)間點(diǎn)熒光信號(hào)的平均值作為基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度值(F?)。隨后，自動(dòng)加樣并連續(xù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度值(F)740s,檢測(cè)時(shí)間共800s。對(duì)于空白對(duì)照孔、溶劑對(duì)照孔、緩沖液對(duì)照孔、陽性對(duì)照孔、受試樣品無辣椒平孔和加辣椒平孔，分別計(jì)算每個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)各孔的相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F?。計(jì)算樣品有/無辣椒平組及對(duì)照組的復(fù)孔在800s的AUC。見公式(1)～公式(6)。6.3二次測(cè)試當(dāng)首次測(cè)試的結(jié)果出現(xiàn)7.4的情況，則進(jìn)行二次試驗(yàn)。試驗(yàn)步驟按6.2進(jìn)行，但在樣品制備時(shí)，將受試溶液以3倍梯度稀釋為6個(gè)濃度，分別加入加樣板的C1孔～C6孔中。測(cè)試完成后，計(jì)算不同濃度受6.4結(jié)果計(jì)算空白對(duì)照組激動(dòng)效果以Ep計(jì)，按公式(1)計(jì)算：……………FBLmx——空白對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度最大值，單位為相對(duì)熒光單位(RFU);F?——基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度值，單位為相對(duì)熒光單位(RFU)。6GB/T43450—2023溶劑對(duì)照組激動(dòng)效果以Esc計(jì)，按公式(2)計(jì)算：式中：F?！A(chǔ)熒光強(qiáng)度值，單位為相對(duì)熒光單位(RFU)。陽性對(duì)照組激動(dòng)效果以Epc計(jì)，按公式(3)計(jì)算：……………(3)式中：F?！A(chǔ)熒光強(qiáng)度值，單位為相對(duì)熒光單位(RFU)。緩沖液對(duì)照組激動(dòng)效果以EHBss計(jì)，按公式(4)計(jì)算： (4)式中：緩沖液對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度最大值，單位為相對(duì)熒光單位(RFU);F?———基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度值，單位為相對(duì)熒光單位(RFU)。受試樣品的激動(dòng)效果以Ec-計(jì)，按公式(5)計(jì)算：………(5)式中：AUCc-——受試樣品無辣椒平的AUC值；AUCpc——陽性對(duì)照的AUC值。辣椒平溶液對(duì)于受試樣品的拮抗效果以Ec+計(jì)，按公式(6)計(jì)算： (6)式中：AUCc+——受試樣品加辣椒平的AUC值；AUCHBss——緩沖液對(duì)照的AUC值；AUCc-——受試樣品無辣椒平的AUC值。7結(jié)果判定7.1首次測(cè)試時(shí)，如Eb小于或等于110%、Esc小于或等于110%、EHss小于或等于110%,同時(shí)Epc大于200%,試驗(yàn)結(jié)果有效。7.2當(dāng)受試樣品的Ec-小于20%,樣品無急性眼刺激性。7.3當(dāng)受試樣品的Ec-大于或等于20%,且Ec+小于或等于75%,樣品具有潛在的急性眼刺激性。7.4當(dāng)受試樣品的Ec-大于或等于20%,但Ec+大于75%,則應(yīng)按6.3進(jìn)行二次測(cè)試。二次測(cè)試的結(jié)果中，受試樣品任一濃度的Ec+小于或等于75%,樣品具有潛在的急性眼刺激性。7.5若測(cè)試結(jié)果不符合7.1～7.4,應(yīng)按照GB/T21609或其他試驗(yàn)方法檢測(cè)。basedontrpvlchannelactivationforpredicti