2025版高考生物一輪總復(fù)習(xí)素養(yǎng)提升選擇性必修3第10單元生物技術(shù)與工程第7講基因工程的基本操作程序和應(yīng)用及蛋白質(zhì)工程

第10單元生物技術(shù)與工程第7講基因工程的基本操作程序和應(yīng)用及蛋白質(zhì)工程構(gòu)|建|網(wǎng)|絡(luò)|情境試題規(guī)范作答|閱讀下列材料，回答下列問題：基因的魔剪——CRISPR/Cas系統(tǒng)二倍體馬鈴薯存在自交不親和的現(xiàn)象，導(dǎo)致無法運(yùn)用種子種植馬鈴薯①。二倍體馬鈴薯的自交不親和是由核糖核酸酶基因(S－RNase)限制的，科研人員通過基因編輯技術(shù)敲除了馬鈴薯的S－RNase基因，獲得自交親和的二倍體馬鈴薯②，為馬鈴薯雜交育種供應(yīng)了新的技術(shù)。如圖是科研人員用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定點(diǎn)敲除S－RNase基因的示意圖。(1)用于編輯不同基因的CRISPR/Cas9復(fù)合物中向?qū)NA堿基序列不同，因此首先要確定S－RNase基因中的待編輯序列，可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增S－RNase基因③，作為編碼特定向?qū)NA的模板。擴(kuò)增時(shí)須要依據(jù)S－RNase基因的脫氧核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端起先連接脫氧核苷酸。(2)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能精準(zhǔn)識(shí)別相關(guān)基因，依據(jù)的原理是向?qū)NA與目標(biāo)DNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)；Cas9蛋白可催化磷酸二酯鍵(填化學(xué)鍵名稱)水解，剪切特定DNA片段。(3)欲檢測(cè)經(jīng)上述基因編輯技術(shù)得到的植株是否已具有自交親和性狀，最簡(jiǎn)便的方法是讓該植株自交，視察能否產(chǎn)生種子。【解題策略】真|題|再|(zhì)現(xiàn)1．(2024·浙江卷)紫外線引發(fā)的DNA損傷，可通過“核苷酸切除修復(fù)(NER)”方式修復(fù)，機(jī)制如圖所示。著色性干皮癥(XP)患者的NER酶系統(tǒng)存在缺陷，受陽光照射后，皮膚出現(xiàn)炎癥等癥狀?；颊哂啄臧l(fā)病，20歲后起先發(fā)展成皮膚癌。下列敘述錯(cuò)誤的是(C)A．修復(fù)過程須要限制酶和DNA聚合酶B．填補(bǔ)缺口時(shí)，新鏈合成以5′到3′的方向進(jìn)行C．DNA有害損傷發(fā)生后，在細(xì)胞增殖后進(jìn)行修復(fù)，對(duì)細(xì)胞最有利D．隨年齡增長(zhǎng)，XP患者幾乎都會(huì)發(fā)生皮膚癌的緣由，可用突變累積說明解析：由圖可知，修復(fù)過程中須要將損傷部位的序列切斷，因此須要限制酶的參與；同時(shí)修復(fù)過程中，單個(gè)的脫氧核苷酸須要依次連接，要借助DNA聚合酶，A正確；填補(bǔ)缺口時(shí)，新鏈即子鏈的延長(zhǎng)方向?yàn)?′到3′的方向進(jìn)行，B正確；DNA有害損傷發(fā)生后，在細(xì)胞增殖中進(jìn)行修復(fù)，保證DNA復(fù)制的正確進(jìn)行，對(duì)細(xì)胞最有利，C錯(cuò)誤；癌癥的發(fā)生是多個(gè)基因累積突變的結(jié)果，隨年齡增長(zhǎng)，XP患者幾乎都會(huì)發(fā)生皮膚癌的緣由，可用突變累積說明，D正確。故選C。2．(2024·浙江卷)某探討小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。試驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3－GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。下列敘述正確的是(B)A．Gata3基因的啟動(dòng)子無法限制GFP基因的表達(dá)B．翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3－GFP基因純合子D．若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子解析：分析圖中可知，啟動(dòng)子在左側(cè)，GFP基因整合在Gata3基因的右側(cè)，啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄后，可以使GFP基因轉(zhuǎn)錄，Gata3基因的啟動(dòng)子能限制GFP基因的表達(dá)，A錯(cuò)誤；因啟動(dòng)子在左側(cè)，轉(zhuǎn)錄的方向向右，合成的mRNA從左向右為5′→3′，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；整合GFP基因后，核酸片段變長(zhǎng)，2號(hào)個(gè)體只有大片段，所以是Gata3－GFP基因純合子，4號(hào)個(gè)體只有小片段，是野生型，C錯(cuò)誤；用引物1和引物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段大小差異較小，無法較好的區(qū)分片段，D錯(cuò)誤。故選B。3．(2024·山東卷)科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J－V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。(1)與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是_RNA聚合酶__。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有_限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等__(答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可)。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物_F2與R1或F1與R2__。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的_a鏈__(填“a鏈”或“b鏈”)相應(yīng)部分的序列相同。(3)重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了_J－V5融合蛋白__，條帶2所檢出的蛋白_不是__(填“是”或“不是”)由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。解析：(1)基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。作為運(yùn)載體必需具備的條件：①要具有限制酶的切割位點(diǎn)；②要有標(biāo)記基因(如抗性基因)，以便于重組DNA分子的篩選；③能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制；④是平安的，對(duì)受體細(xì)胞無害，而且要易從供體細(xì)胞分別出來，圖中甲有啟動(dòng)子和終止子等，因此質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有限制酶的切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等。(2)據(jù)圖甲可知，引物F2與R1或F1與R2結(jié)合部位包含J基因的堿基序列，因此推想為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F2與R1或F1與R2。b是模板鏈，而依據(jù)圖上啟動(dòng)子和終止子的位置可知轉(zhuǎn)錄方向是圖上從左向右，對(duì)應(yīng)的模板鏈方向應(yīng)當(dāng)是3′－5′，非模板鏈(也就是a鏈)是5′－3′；考慮到DNA復(fù)制的方向是子鏈的5′－3′，引物延長(zhǎng)的方向確定是5′－3′，所以引物結(jié)合的單鏈其方向是3′－5′；圖中F1是前引物，在左側(cè)，所以其配對(duì)的單鏈?zhǔn)?′－5′的b鏈，故其序列應(yīng)當(dāng)與a鏈相應(yīng)部分的序列相同。(3)據(jù)圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)，均出現(xiàn)條帶1，說明條帶1是J－V5融合蛋白?？笿蛋白抗體檢測(cè)出現(xiàn)條帶2，抗V5抗體檢測(cè)不出條帶2，說明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。4．(2024·廣東卷)種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。探討者對(duì)野生型擬南芥(2n＝10)進(jìn)行誘變篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測(cè)序，發(fā)覺野生型DAI基因發(fā)生一個(gè)堿基G到A的替換，突變后的基因?yàn)殡[性基因，據(jù)此推想突變體的表型與其有關(guān)，開展相關(guān)試驗(yàn)?；卮鹣铝袉栴}：(1)擬接受農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變?cè)斐?，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型植株的種子大小相近。(2)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAI基因，用限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)PCR產(chǎn)物和運(yùn)載體進(jìn)行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備啟動(dòng)子和終止子。(3)轉(zhuǎn)化后，T－DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換)可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分別及自由組合定律的前提下，選出單一位點(diǎn)插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株(如圖)，用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培育基上，能夠萌發(fā)并生長(zhǎng)的陽性個(gè)體即表示其基因組中插入了DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培育基，選擇陽性率約75%的培育基中幼苗接著培育。③將②中選出的T2代陽性植株自交(填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培育基，陽性率達(dá)到100%的培育基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。為便于在后續(xù)探討中檢測(cè)該突變，探討者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變型基因片段，再運(yùn)用限制性內(nèi)切核酸酶X切割產(chǎn)物，通過核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測(cè)，相關(guān)信息見下，在電泳圖中將酶切結(jié)果對(duì)應(yīng)位置的條帶涂黑。答案：(3)③解析：(1)依據(jù)題干信息可知，突變后的基因?yàn)殡[性基因，則野生型DAI基因?yàn)轱@性基因，因此接受農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變?cè)斐?，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型植株的種子大小相近。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DAI基因后，應(yīng)當(dāng)用同種限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)DAI基因和運(yùn)載體進(jìn)行切割，再用DNA連接酶將兩者連接起來；在基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子位于目的基因的首端，終止子位于目的基因的尾端，因此為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備啟動(dòng)子和終止子。(3)①依據(jù)題干信息和圖形分析，將T0代植株的花序浸沒在農(nóng)桿菌(T－DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)液中轉(zhuǎn)化，再將獲得的T1代種子播種在選擇培育基(含有卡那霉素)上，若在選擇培育基上有能夠萌發(fā)并生長(zhǎng)的陽性個(gè)體，則說明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因組中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代陽性植株都含有DAI基因，由于T－DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換)可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)，所以不確定是單一位點(diǎn)插入還是多位點(diǎn)插入，若是單一位點(diǎn)插入，相當(dāng)于一對(duì)等位基因的雜合子，其自交后代應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)3∶1的性狀分別比，而題干要求選出單一位點(diǎn)插入的植株，因此應(yīng)當(dāng)選擇陽性率約75%的培育基中幼苗接著培育。③將以上獲得的T2代陽性植株自交，再將得到的T3代種子按單株收種并播種于選擇培育基上，若某培育基上全部為具有卡那霉素抗性的植株即為須要選擇的植株，即陽性率達(dá)到100%的培育基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。依據(jù)圖形分析，野生型和突變型基因片段的長(zhǎng)度都是150bp，野生型的基因沒有限制酶X的切割位點(diǎn)，而突變型的基因有限制酶X的切割位點(diǎn)，結(jié)合圖中的數(shù)據(jù)分析可知電泳圖中，野生型只有150bp，突變型有50bp和100bp，如圖：5．(2024·遼寧卷)PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的緣由，探討者從基因數(shù)據(jù)庫中獲得了該蛋白的基因編碼序列(簡(jiǎn)稱phb2基因)，大小為0.9kb(1kb＝1000堿基對(duì))，利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白。回答下列問題：(1)為獲得phb2基因，提取該動(dòng)物肝臟組織的總RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程得到cDNA，將其作為PCR的模板，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來擴(kuò)增目的基因。(2)圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見下表。為使phb2基因(該基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列)與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入EcoRⅠ和PstⅡ兩種不同限制酶的識(shí)別序列。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用T4_DNA連接酶(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)HindⅢA↓AGCTTTTCGA↑AEcoRⅠG↓AATTCCTTAA↑GPstⅡCAG↓CTGGTC↑GACPstⅠCTGC↓AGGA↑CGTCKpnⅠG↓GTACCCCATG↑GBamHⅠG↓GATCCCCTAG↑G注：箭頭表示切割位點(diǎn)(3)轉(zhuǎn)化前需用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于感受態(tài)的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。(4)將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培育基上進(jìn)行培育，隨機(jī)挑取菌落(分別編號(hào)為1、2、3、4)培育并提取質(zhì)粒，用(2)中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分別，結(jié)果如圖2，3號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。注：M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中解析：(1)利用RNA獲得cDNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄。(2)依據(jù)啟動(dòng)子和終止子的作用可知，目的基因應(yīng)導(dǎo)入啟動(dòng)子和終止子之間，從圖中看出，兩者之間存在三種限制酶切點(diǎn)，但是由于KpnⅠ在質(zhì)粒上不止一個(gè)酶切位點(diǎn)，所以應(yīng)當(dāng)選擇EcoRⅠ和PstⅡ兩種不同限制酶；依據(jù)PstⅡ的酶切序列可知，其酶切產(chǎn)物為平末端，所以構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)當(dāng)用T4DNA連接酶連接質(zhì)粒和目的基因。(3)轉(zhuǎn)化時(shí)用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于感受態(tài)的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。(4)由于這些菌落都可以生長(zhǎng)在含有氨芐青霉素的培育基中，因此都含有質(zhì)粒，重組質(zhì)粒包含了目的基因和質(zhì)粒，假如用EcoRⅠ和PstⅡ兩種酶切割重組質(zhì)粒，電泳后將獲得含有質(zhì)粒和目的基因兩條條帶，由于phb2基因大小為0.9kb，所以對(duì)應(yīng)電泳圖中的菌落3。6．(2024·山東卷)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過影響這一過程對(duì)該病起到治療作用。為探究藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。(1)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是兩種引物分別與兩條模板鏈3′端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的5′端(填“3′端”或“5′端”)。(2)PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的緣由是在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中，限制酶識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的最終兩個(gè)堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個(gè)堿基構(gòu)成一個(gè)密碼子，導(dǎo)致讀碼框變更，翻譯出的氨基酸序列變更。修改擴(kuò)增P基因時(shí)運(yùn)用的帶有EcoRⅠ識(shí)別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是在EcoRⅠ識(shí)別序列前后增加堿基，使其堿基數(shù)目加上FLAG的堿基數(shù)目為3的倍數(shù)。(3)融合蛋白表達(dá)成功后，將FLAG－P、FLAG－P△、藥物A和UBC依據(jù)圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分別出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③組結(jié)果的差異推想，藥物A的作用是促進(jìn)UBC與FLAG－P的結(jié)合；由②④組或③⑤組的差異推想，P△中缺失的特定序列的作用是P△中缺失的特定序列是與U