11q23異常小兒急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞對TRAIL的敏感性研究

1/111q23異常小兒急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞對TRAIL的敏感性研究11q23異常小兒急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞對TRAIL的敏感性研究【摘要】目的觀察11q23異常小兒急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞對腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)所介導(dǎo)的細(xì)胞毒的敏感性，并探討其機(jī)制。

方法以11q23異常ALL細(xì)胞株3株及原代細(xì)胞為研究對象，通過測定細(xì)胞表面TRAIL受體表達(dá)、TRAIL作用后細(xì)胞的存活率及凋亡，觀察11q23異常ALL對TRAIL的敏感性。

結(jié)果除KOCL33對TRAIL部分敏感外，KOCL69、KOPB26及原代細(xì)胞對TRAIL高度耐受。

原代細(xì)胞及3個細(xì)胞株DR4均呈陰性，DR5在KOCL33呈強(qiáng)陽性，而在其他細(xì)胞株呈陰性，原代細(xì)胞及3個細(xì)胞株均未表達(dá)DcR1及DcR2。

結(jié)論11q23異常ALL細(xì)胞對TRAIL耐受的原因可能是細(xì)胞表面凋亡受體表達(dá)低下，并有可能是小兒11q23異常ALL迅速克隆擴(kuò)增及GVL效應(yīng)差的重要機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】11q23;急性淋巴細(xì)胞白血病;凋亡誘導(dǎo)配體40%~70%的嬰幼兒急性白血病(infantacuteleukemia,IAL)存在11q23的染色體異常，包括易位、倒位、插入和缺失等，以t(4;11)(q21;q23)為最常見[1-2]。

11q23異常白血病大多惡性程度高，對化療不敏感，完全緩解率(completeremission,CR)低，預(yù)后惡劣，且同種造血干細(xì)胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation,allo-SCT)無助于改善預(yù)后[3]。

腫瘤的免疫監(jiān)視受固有免疫和適應(yīng)性細(xì)胞免疫調(diào)控，其中主要包括自然殺傷細(xì)胞(naturalkiller,NK)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)[4-5]。

研究表明，腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)相關(guān)的誘導(dǎo)凋亡配體(TNF-relatedapoptosis-inducingligand,TRAIL)在CTL和NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中起重要作用[6-9]。

本研究中我們探討了11q23異常急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞對重組人可溶性TRAIL(rhsTRAIL)的敏感性，研究結(jié)果如下。

1材料和方法1.1研究對象1.1.1細(xì)胞株及臨床標(biāo)本11q23異常ALL細(xì)胞株3株，其中KOCL33為t(11;19)、具有FLT3-D835突變[10];KOCL69為t(4;11);KOPB26為t(9;11)。

Nalm1用作TRAIL敏感性對照，11q23異常ALL細(xì)胞株3株及幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞株來自日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部小兒科。

細(xì)胞株在37℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱條件下，培養(yǎng)于含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液中。

取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1例患者[5月齡女孩，t(4;11)]的骨髓經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離出單個核細(xì)胞(原始細(xì)胞gt;95%)，RPMI1640培養(yǎng)基離心洗滌，懸于加有10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1.2試劑及材料rhsTRAIL(KillerTRAIL)購于Alexis公司，Caspase廣譜抑制劑z-VAD-fmk、購于美國Sigma公司;Annexin-V-FITC購于BestBio(貝博，上海);DR4、DR5、DcR1及DcR2的單克隆抗體由順天堂大學(xué)八木田秀雄先生惠贈。

1.3實驗方法1.3.13H標(biāo)記的胸腺嘧啶腺苷滲入法將RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)制成2.0105細(xì)胞mL-1細(xì)胞懸液，接種于24孔板，每孔液體量為1mL(最終濃度1105細(xì)胞mL-1)。

對照孔加入新鮮培養(yǎng)液，TRAIL孔加入rhsTRAIL100ngL-1作用24h，收集細(xì)胞，調(diào)制成1.0106細(xì)胞mL-1細(xì)胞懸液，接種于96孔平底培養(yǎng)板中，每孔100L(最終濃度0.5105細(xì)胞mL-1)，并做三個平行樣。

培養(yǎng)板按指定方法孵育36h，并在培養(yǎng)的最后6h內(nèi)給予3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脈沖(每孔1Ci)，然后收集到玻璃纖維濾器上。

用液體閃爍計數(shù)器計算整合入DNA的放射活性。

通過添加或者不添加三倍稀釋(最終濃度11、33、100ngmL-1)rhsTRAIL培養(yǎng)基中的42h孵育結(jié)果，確定rhsTRAIL的效果。

分別加入rhsTRAIL中和性抗體RIK-2(10gm-1)或z-VAD-fmk(20M)LLnL(2.5M)，阻斷rhsTRAIL或caspases活性。

rhsTRAIL的阻斷率由以下公式算出：

{1-[(處理孔的每分鐘記數(shù)次數(shù))/(未處理孔的每分鐘記數(shù)次數(shù))]}100。

1.3.2細(xì)胞存活率及和凋亡的檢測將RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)制成2.0105細(xì)胞mL-1細(xì)胞懸液，接種于24孔板，每孔液體量為1mL(最終濃度1105細(xì)胞mL-1)。

對照孔加入新鮮培養(yǎng)液，TRAIL孔加入rhsTRAIL100ngL-1作用24h后收集細(xì)胞。

a.臺盼藍(lán)拒染法確定細(xì)胞的存活率，并用以下公式計算細(xì)胞存活比率：

(未添加rhsTRAIL培養(yǎng)基中的細(xì)胞存活比率)-(添加rhsTRAIL培養(yǎng)基中的細(xì)胞存活比率)。

b.用FITC標(biāo)記的Annexin-V染色，流式細(xì)胞儀(BD,FACSCalibur)檢測早期凋亡。

1.3.2TRAIL受體在細(xì)胞表面的表達(dá)細(xì)胞株、臨床標(biāo)本以及幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞株(1106個細(xì)胞)與1g生物素標(biāo)記的鼠IgG1或者單抗在冰上孵育30min，隨后與藻紅蛋白標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素(上海亞培生物科技)冰上孵育30min，用流式細(xì)胞儀檢測。

相對熒光強(qiáng)度(RFI)為特異染色的平均熒光強(qiáng)度與對照染色的平均熒光強(qiáng)度之比。

2結(jié)果2.1TRAIL對11q23異常ALL細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用rhsTRAIL顯著抑制Ph1陽性細(xì)胞Nalm1的生長。

3株11q23異常ALL細(xì)胞中，KOCL33對TRAIL部分敏感，而KOCL69和KOPB26對TRAIL高度耐受(圖1a)。

臺盼藍(lán)拒染試驗結(jié)果與3H-胸腺嘧啶核苷滲入實驗結(jié)果一致，KOCL33對TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞毒中度敏感，而KOCL69和KOPB26不敏感(圖1b)。

圖1aTRAIL對11q23異常ALL細(xì)胞株存活率圖1bTRAIL對11q23異常ALL細(xì)胞株存活率的作用(3H標(biāo)記的胸腺嘧啶腺苷滲入法)的作用(臺盼藍(lán)拒染試驗)添加rhsTRAIL(100ngmL-1)培養(yǎng)12h后，KOCL33細(xì)胞中與Annxin-V結(jié)合的凋亡細(xì)胞百分率中度增加，而KOCL69和KOPB26無明顯變化(圖1c)。

TRAIL的中和抗體RIK-2和廣譜caspase抑制劑z-VAD-fmk都能完全阻斷TRAIL的活性(圖1d)，提示TRAIL對KOCL33的作用為caspase依存性及特異性。

圖1cTRAIL對11q23異常ALL細(xì)胞株早期凋亡的作用圖1dTRAIL中和抗體對TRAIL活性的影響2.211q23異常ALL細(xì)胞株TRAIL受體的表達(dá)用特異性單克隆抗體，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面TRAIL受體DR4、DR5、DcR1、DcR2的表達(dá)。

每個單抗均可特異性結(jié)合已轉(zhuǎn)染不同人類TRAIL受體cDNA的BHK細(xì)胞系(圖2a)。

細(xì)胞株表面TRAIL受體的相對熒光強(qiáng)度如圖2b所示，3株細(xì)胞DR4均呈陰性，DR5在KOCL33呈強(qiáng)陽性，而其它2個細(xì)胞株呈陰性。

3個細(xì)胞株表面均未檢測出DcR1及DcR2。

圖2aTRAIL受體單克隆抗體的特異性檢測圖2b11q23異常ALL細(xì)胞株表面TRAIL受體的表達(dá)檢測2.3TRAIL對11q23異常ALL細(xì)胞的細(xì)胞毒作用分離1例患者[5月齡女孩，t(4;11)]骨髓單個核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測TRAIL受體在細(xì)胞表面的表達(dá)，添加TRAIL孵育12h后流式細(xì)胞儀檢測AnnexinV結(jié)合細(xì)胞率變化，孵育24h后臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞存活率變化。

細(xì)胞表面DR4、DR5呈弱陽性，而DcR1、DcR2為陰性(圖3a)。

添加TRAIL后，活細(xì)胞減少率、AnnexinV結(jié)合細(xì)胞率均無明顯變化(圖3b)。

圖3a11q23異常ALL原代細(xì)胞表面圖3bTRAIL對11q23異常ALL原代細(xì)胞存活率TRAIL受體的表達(dá)檢測及早期凋亡的影響3討論惡性腫瘤細(xì)胞通常獲得逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的能力以實現(xiàn)迅速克隆擴(kuò)增[4]，免疫逃避機(jī)制與allo-SCT后移植物抗白血病(graft-versus-leukemia,GVL)效應(yīng)失敗有關(guān)[11]。

因此，11q23異常白血病在發(fā)生過程中可能獲得某種免疫逃避能力，導(dǎo)致allo-SCT后GVL效應(yīng)失敗。

TRAIL與其死亡受體DR4[12]及DR5[13]結(jié)合，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[9]，相反，TRAIL的其它兩種細(xì)胞表面受體DcR1和DcR2缺乏死亡結(jié)構(gòu)域活性，它們競爭DR4和DR5與TRAIL的結(jié)合，稱為誘騙受體。

正常細(xì)胞選擇性表達(dá)誘騙受體，因此TRAIL能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞無影響。

在動物模型中，TRAIL選擇性作用于人類腫瘤移植物，而對正常組織無毒性，進(jìn)一步證實了其作為抗癌藥物的潛力[14]。

在TRAIL缺陷的骨髓移植小鼠模型中，TRAIL為供體T細(xì)胞發(fā)揮移植物抗腫瘤(GVT)效應(yīng)時所必須，但在移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease,GVHD)中幾無作用[15]。

本研究的三株11q23異常ALL細(xì)胞中，除KOCL33對rhsTRAIL部分敏感外，其余對TRAIL顯著耐受。

3株細(xì)胞表面DR4均呈陰性，DR5在KOCL33呈強(qiáng)陽性，而其它2個細(xì)胞株均呈陰性，所有3個細(xì)胞株表面均未檢出DcR1及DcR2。

原代細(xì)胞表面DR4、DR5也幾乎無表達(dá)，DcR1、DcR2為陰性。

這提示，11q23異常ALL細(xì)胞對TRAIL顯著耐受，其主要原因可能是細(xì)胞表面DR4、DR5表達(dá)水平過低。

KOCL33雖然DR5強(qiáng)陽性，誘騙受體陰性，但對rhsTRAIL僅為中度敏感，可能與KOCL33存在FLT3-D835突變有關(guān)。

研究表明，在all-SCT后CTL和NK細(xì)胞所介導(dǎo)的GVL效應(yīng)中，TRAIL起著關(guān)鍵作用[9]。

曾有報道，TRAIL能有效誘導(dǎo)Ph1-陽性ALL細(xì)胞凋亡，可能是Ph1-陽性ALLallo-SCT效果良好的關(guān)鍵因素之一[12]。

11q23異常ALL細(xì)胞株對TRAIL普遍耐受，提示這些白血病細(xì)胞可能對GVL效應(yīng)不敏感。

由于TRAIL涉及固有免疫監(jiān)視和適應(yīng)性免疫監(jiān)視[5,8]，TRAIL耐受有助于早期11q23異常ALL細(xì)胞逃離免疫攻擊并進(jìn)一步促進(jìn)克隆擴(kuò)增。

值得注意的是，11q23異常白血病細(xì)胞如何獲得TRAIL耐受性,正常組織通常對TRAIL耐受，因為正常細(xì)胞選擇性表達(dá)誘騙受體，所以TRAIL能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對正常細(xì)胞無影響，而在腫瘤發(fā)生過程中，新生物通常獲得對TRAIL的敏感性。

據(jù)報道，在靜止的CD34陽性造血祖細(xì)胞表面檢測不到TRAIL的四種受體[16]，而11q23異常ALL起源于具有多重分化潛能的造血干細(xì)胞，提示11q23異常ALL細(xì)胞表現(xiàn)出造血干祖細(xì)胞的特點。

更重要的是，近來有報道稱，單核細(xì)胞在分化過程中，TRAIL的四種受體是可以誘導(dǎo)的[16]。

11q23異常ALL細(xì)胞可能通過某種途徑，逃避了白血病發(fā)生過程中DR4/DR5的上調(diào)或者誘騙受體的下調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞對TRAIL耐受，這給我們進(jìn)一步研究提供了方向。

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