DB54T-青稞中燕麥鐮刀菌LAMP檢測技術(shù)規(guī)范

Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h\t"標(biāo)準(zhǔn)文件_一級條標(biāo)題,2,標(biāo)準(zhǔn)文件_附錄一級條標(biāo)題,2,"前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14方法原理 15試劑和材料 16儀器和設(shè)備 27測定步驟 28結(jié)果判定 3前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由西藏自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會提出并歸口。本文件起草單位：本文件主要起草人：青稞中燕麥鐮刀菌LAMP檢測技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了青稞中燕麥鐮刀菌LAMP檢測方法的方法原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、測定步驟和結(jié)果判定。本文件適用于青稞中燕麥鐮刀菌的檢測。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范視頻分子生物學(xué)檢測術(shù)語和定義請選擇適當(dāng)?shù)囊龑?dǎo)語環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP在等溫（60℃~65℃）條件下，利用鏈置換DNA聚合酶，60min內(nèi)實現(xiàn)脫氧核糖核酸擴增的技術(shù)。方法原理擴增原理根據(jù)燕麥鐮刀菌的翻譯延伸因子序列中特異性序列設(shè)計特異性內(nèi)、外引物一組，引物特異性性識別目標(biāo)序列上的六個獨立區(qū)域，利用BstDNA聚合酶啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在同一鏈上互補序列周而復(fù)始形成很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物，加入顯色液即可通過顏色變化觀察判定結(jié)果。SYBRGreenI染料顯色原理SYBRGreenI是一種高靈敏度的DNA熒光染料，可以嵌入方式結(jié)合到雙鏈DNA雙螺旋小溝區(qū)域內(nèi)。當(dāng)它與雙鏈DNA結(jié)合時，熒光信號是游離狀態(tài)的800～1000倍。在不發(fā)生擴增反應(yīng)時，SYBRGreenI熒光信號很弱，顏色顯現(xiàn)為橙色；當(dāng)發(fā)生擴增反應(yīng)時，隨著雙鏈DNA的增加，SYBRGreenI的熒光信號也隨之大幅度增強，其信號強度與雙鏈DNA分子的數(shù)量相關(guān)，同時顏色由橙色變?yōu)榫G色。試劑和材料除有特殊說明外，所有實驗用試劑均為分析純，試驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的要求。引物：根據(jù)燕麥鐮刀菌DNA的翻譯延伸因子序列基因設(shè)計一套特異性引物，包括外引物1、外引物2和內(nèi)引物1、內(nèi)引物2。外引物（F3，5’~3’）1：GTGATACCACGCTCACGC外引物（B3，5’~3’）2：GGTATCTTACCCCGCCACT內(nèi)引物（FIP，5’~3’）1：AATAGGAAGCCGCCGAGCTCTGAGCTTGTCAAGAACCCAG內(nèi)引物（BIP，5’~3’）2：TGGCTGCAAGACATAGTGCGCGATGCGCTTGCCCTGTTC等溫擴增PCR混合液（2×LAMPPCRMasterMix)本產(chǎn)品購置于生工生物（上海）股份有限公司。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。)）:包含0mmol/LTris~HCl、20mmol/L(NH4)2SO4、20mmol/LKCl（pH8.8）、16mmol/LMgSO4、2.0mmol/LdNTPs、0.2%TrionX~100)本產(chǎn)品購置于生工生物（上海）股份有限公司。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。DNA快速提取試劑：DNA~EZReagentsAll~DNA~Fast~Out)本產(chǎn)品購置于生工生物（上海）股份有限公司。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。))本產(chǎn)品購置于生工生物（上海）股份有限公司。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。BstDNA聚合酶：酶濃度8U/μL甜菜堿：5mol/L。顯色液：SYBRGreenI熒光染料，1000×。離心管:1.5mL。塑料研磨棒：長度70cm，研磨頭外徑6.2mm，研磨頭長度9.5mm。吸頭：配套可調(diào)移液器使用。儀器和設(shè)備可調(diào)移液器：1μL~10μL，10μL~100μL，100μL~1000μL水浴鍋或加熱模塊（62℃±1℃、80℃±1℃和100℃±1℃）.計時器。測定步驟試驗設(shè)置陰性對照：采用不含有目標(biāo)基因序列的燕麥鐮刀菌基因組DNA為模板。陽性對照：采用含有目標(biāo)基因序列的燕麥鐮刀菌基因組DNA為模板?？瞻讓φ眨阂运鍰NA模板。試樣采集進行田間青稞中燕麥鐮刀菌快速檢測時，切取0.5cm×0.5cm待檢測的青稞籽粒樣品，放置于1.5mL離心管中保存并標(biāo)記。試樣DNA提取將100μL的DNA快速提取液加入到盛有試樣的1.5mL離心管，用研磨棒研磨5min。100℃±1℃加熱5min。用手震蕩混勻后取裂解物直接進行LAMP反應(yīng)。LAMP反應(yīng)步驟反應(yīng)體系LAMP反應(yīng)體系見表1。每個試樣各做2個平行管，加樣時使試樣DNA溶液完全加入反應(yīng)液。在反應(yīng)體系配置完成后，將1μL顯色液滴于反應(yīng)罐的管蓋內(nèi)測。LAMP反應(yīng)體系組分工作液濃度加入量（μL）外引物（F3）110μmol/L0.6外引物（B3）210μmol/L0.6內(nèi)引物（FIP）140μmol/L0.6內(nèi)引物（BIP）240μmol/L0.6等溫擴增PCR混合液2×12.5甜菜堿4mol/L1.6BstDNA聚合酶8U/μL0.5DNA模板~1水~3反應(yīng)過程62℃±1℃恒溫擴增40min，80℃±1℃持續(xù)10min，反應(yīng)結(jié)束。顯色反應(yīng)反應(yīng)結(jié)束后，將顯色液與反應(yīng)液上下顛倒混勻，立即在正常光照于黑色背景下進行顏色觀察。陰性對照：反應(yīng)管中液體呈橙色。陽性對照：反應(yīng)管中液體呈綠色?？瞻讓φ眨悍磻?yīng)管中液體呈橙色。生物安全和防污染措施實驗室生物安全應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測過程的防污染措施應(yīng)符合GB/T27403中附錄D規(guī)定。結(jié)果判定待測樣品2個