蛋白質的分離純化

關于蛋白質的分離純化蛋白質的分離純化透析和超過濾超速離心層析（色譜）

(chromatography)電泳

(electrophoresis)第2頁,共42頁，星期六，2024年，5月1透析和超過濾

P302第3頁,共42頁，星期六，2024年，5月2超速離心

P302第4頁,共42頁，星期六，2024年，5月

基本原理：層析由流動相和固定相組成樣品作為流動相流過固定相各組分在兩相中分布程度不同各成分遷移率不同分離3層析（色譜）（Chromatography）

P148第5頁,共42頁，星期六，2024年，5月兩相：固定相（靜相）和流動相（動相）有效分配系數(shù)：第6頁,共42頁，星期六，2024年，5月層析按流動相：氣相、液相色譜等；按操作形式不同：紙層析、薄層層析、柱層析等；按分離機制：凝膠層析、離子交換層析、親和層析、吸附層析等。第7頁,共42頁，星期六，2024年，5月3.1紙層析

（Filter-paperchromatography）相對遷移率

P151第8頁,共42頁，星期六，2024年，5月3.2薄層層析

（Thin-layerchromatography）

P152第9頁,共42頁，星期六，2024年，5月3.3柱層析第10頁,共42頁，星期六，2024年，5月①凝膠過濾層析

(分子排阻層析、分子篩層析）

（Gel-filtrationchromatography）根據蛋白質分子大小不同來分離純化蛋白質的一種方法。

P303第11頁,共42頁，星期六，2024年，5月介質：凝膠顆粒（多孔的網狀結構）交聯(lián)度或孔度（網孔大?。z的分級分離范圍交聯(lián)葡聚糖——SephadexG-50（1500-30000）瓊脂糖——Sepharose或Bio-GelA聚丙烯酰胺——Bio-GelP第12頁,共42頁，星期六，2024年，5月原理：第13頁,共42頁，星期六，2024年，5月②離子交換層析

（Ion-exchangechromatography）根據蛋白質所帶電荷的不同進行分離純化。介質：離子交換樹脂溶液中的離子與樹脂上的帶電基團進行交換反應；各種離子交換能力不同，與樹脂結合的牢固程度就不同；在洗脫過程中，各種離子遷移率不同，達到分離的目的。

P152和310第14頁,共42頁，星期六，2024年，5月第15頁,共42頁，星期六，2024年，5月第16頁,共42頁，星期六，2024年，5月第17頁,共42頁，星期六，2024年，5月第18頁,共42頁，星期六，2024年，5月茚三酮反應：生成紫色物質脯氨酸和羥脯氨酸生成黃色物質

氨基酸的定性定量第19頁,共42頁，星期六，2024年，5月第20頁,共42頁，星期六，2024年，5月

根據蛋白質與特異的配體相互作用來分離的。蛋白質＋配體蛋白質配體復合物③親和層析

(Affinitychromatography)

P313第21頁,共42頁，星期六，2024年，5月第22頁,共42頁，星期六，2024年，5月第23頁,共42頁，星期六，2024年，5月第24頁,共42頁，星期六，2024年，5月第25頁,共42頁，星期六，2024年，5月④高效液相層析（High-Performanceliquidchromatography,HPLC）

P154和314也分為凝膠過濾層析、離子交換層析和親和層析等特點：固定相支持劑顆粒細采取高壓，洗脫速度增大第26頁,共42頁，星期六，2024年，5月第27頁,共42頁，星期六，2024年，5月4電泳(Electrophoresis)在外電場存在下，利用蛋白質分子攜帶的凈電荷不同以分離混合物ArneTiselius獲1948年諾貝爾化學獎

P307第28頁,共42頁，星期六，2024年，5月4.1凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠（蛋白質和多核苷酸）瓊脂糖凝膠（核酸）第29頁,共42頁，星期六，2024年，5月電泳儀水平電泳槽垂直電泳槽第30頁,共42頁，星期六，2024年，5月聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）不連續(xù)：濃縮膠和分離膠電泳遷移率決定于所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。+凝膠加樣

P309第31頁,共42頁，星期六，2024年，5月巰基乙醇：打開二硫鍵。SDS：變性劑，破裂蛋白質分子中的氫鍵和疏水作用。

SDS以其氫鍵與蛋白質分子的側鏈結合成復合體。①帶有很多負電荷——遠遠超過蛋白質分子原有電荷②改變了蛋白質單體分子的構象：近似雪茄煙形的長橢圓棒，

短軸長度相同，長軸長度隨蛋白質的相對分子質量成正比例變化。遷移率主要取決于蛋白質相對分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）第32頁,共42頁，星期六，2024年，5月第33頁,共42頁，星期六，2024年，5月遷移率第34頁,共42頁，星期六，2024年，5月4.2等電聚焦電泳高分辨率的蛋白質分離技術。在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場的作用下各種蛋白質將移向并聚焦（停留）在等于其等電點的pH梯度處，并形成一個很窄的區(qū)帶。特別適用于同功酶的鑒定。只要它們的pI有0.02pH單位的差別就能分開。

P310第35頁,共42頁，星期六，2024年，5月第36頁,共42頁，星期六，2024年，5月等電聚焦電泳電泳時，每種蛋白遷移至與它的pI相一致的pH處加入蛋白樣品電場作用下在凝膠中建立穩(wěn)定的一個pH梯度第37頁,共42頁，星期六，2024年，5月第38頁,共42頁，星期六，2024年，5月等電聚焦電泳+SDS-PAGE第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離至各自的等電點；再沿垂直的方向進行分子量的分離.4.3雙向電泳pI降低分子量減小