乙肝丙肝核酸檢測的新平臺臨床

乙肝丙肝核酸檢測的新平臺臨床目前乙肝和丙肝臨床治療過程中遇到得主要問題治療終點無法準確判定有些病人經(jīng)一段時間治療后DNA/RNA檢測結果忽陰忽陽,但臨床癥狀依然明顯不能及時預測耐藥(病毒學突破)核苷(酸)類似物治療后病毒DNA/RNA快速下降至檢測限以下,不久卻發(fā)現(xiàn)病毒出現(xiàn)反跳療效得準確監(jiān)測？？？治療后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接決定預后問題得根源在哪里？內(nèi)容HBV核酸檢測得現(xiàn)狀與需要HCV核酸檢測得現(xiàn)狀與需要羅氏得CAP/CTM能帶來什么益處總結HBVDNA監(jiān)測在抗病毒治療中得臨床應用HBVDNA就是監(jiān)測抗病毒治療響應和時間得關鍵標志物HBV治療得路線圖理念,為HBVDNA監(jiān)測用于臨床實踐提供了指導對用藥耐藥性得監(jiān)測(拉米夫定－YMDD,…)肝移植HBV復發(fā)風險得降低(術前,術后)……HBVDNA監(jiān)測得臨床應用HBV治療路線圖

KeeffeE、ClinGastroHepatology2007;5:890-897、侯金林等,慢性乙型肝炎抗病毒治療方案優(yōu)化,中國肝臟病雜志國產(chǎn)試劑現(xiàn)狀目前使用得國產(chǎn)試劑能解決得問題,不能解決得問題:HBV試劑盒說明:500～5×107IU/mL較可信得測試范圍:104～5×107IU/mL對部分發(fā)生HBV病毒突變得病人無法準確檢測注:1IU/mL=1copy/mL內(nèi)容HBV核酸檢測得現(xiàn)狀與需要HCV核酸檢測得現(xiàn)狀與需要羅氏得CAP/CTM能帶來什么益處總結HCVDNA監(jiān)測在抗病毒治療中得臨床應用HCV病毒感染就是可治愈得疾病HCVRNA檢測可以有效指導臨床用藥治療得終點就是核酸檢測為陰性(核酸檢測可以直接指導停藥時機)慢性HCV治療方案治療應答名稱描述快速病毒學應答(RVR)4周時未檢測到HCVRNA早期病毒學應答(EVR)-完全早期病毒學應答(cEVR)未RVR,但12周時未檢測到HCVRNA-部分早期病毒學應答(pEVR)未RVR,12周時HCVRNA拷貝數(shù)下降≥2log10,但仍檢測到HCVRNA沒有應答12周時HCVRNA拷貝數(shù)下降<2log10治療結束(EOT)治療結束未檢測到HCVRNA持續(xù)病毒學應答(SVR)治療結束后24周,未檢測到HCVRNA反彈治療期間曾有HCVRNA低于檢出限,但尚未停藥即出現(xiàn)HCVRNA重新升高復發(fā)治療期間HCVRNA低于檢出限,但治療結束(停藥)后HCVRNA重新升高慢性HCV治療方案用藥12周早期病毒學反應HCVRNA下降<2logHCV病毒檢測陰性HCV病毒檢測陽性停藥HCV病毒檢測陰性治療到24周HCVRNA檢測HCVRNA下降>2log繼續(xù)治療至48周繼續(xù)治療至24周考慮停藥國產(chǎn)試劑現(xiàn)狀目前使用得國產(chǎn)試劑能解決得問題,不能解決得問題:HCV試劑盒說明:500～5×107IU/mL較可信得測試范圍:104～5×107IU/mL注:1IU/mL=1copy/mL大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜內(nèi)容HBV核酸檢測得現(xiàn)狀與需要HCV核酸檢測得現(xiàn)狀與需要羅氏得CAP/CTM能帶來什么益處總結全世界第一臺用于體外診斷得全自動熒光定量分子診斷系統(tǒng)真正實現(xiàn)“樣品進,結果出”全球安裝超過2,000臺,國內(nèi)安裝超過40臺COBASAmpliPrep/COBASTaqMan系統(tǒng)COBASAmpliPrep/COBASTaqMan48?系統(tǒng)COBASAmpliPrep/COBASTaqMan96?系統(tǒng)(帶連接系統(tǒng))COBASAmpliPrep/COBASTaqMan96?系統(tǒng)

(無連接系統(tǒng))COBASAmpliPrep儀器簡介全自動系統(tǒng),自動進行核酸提取純化和PCR反應體系配制基于MGP磁珠分離技術,確保高質量得核酸提取純化最多72個樣品可以同時上機,運行中可連續(xù)裝載上架,提高工作效率包括耗材、樣品、試劑均可以連續(xù)上樣DNA或者RNA1、裂解、穩(wěn)定和去蛋白2、核酸捕獲病毒或細胞3、沖洗4、洗脫37°C孵育COBASAmpliPrep儀器

MGP磁珠分離技術室溫80°C孵育取SPU槍頭樣本管/反應管管蓋抓手樣本初始體積感應器取試劑鋼針CAP機械臂介紹樣本管/反應管結構COBAS

TaqMan/COBASTaqMan48分析儀簡介檢測通量可達4*24測試獨立得24孔熱循環(huán)儀TaqMan48有2個模塊,TaqMan96有4個模塊最多可同時進行4個不同得分析檢測操作簡單,核酸擴增和檢測全部自動完成實時定量PCR檢測技術,卓越得檢測性能,靈敏度高和特異性好,動態(tài)范圍寬HBV-DNA定量測試用于藥品FDA注冊試驗通用名商品名

FDA批準日期關鍵得HBV-DNA測試Interferonalfa-2bα-2b干擾素

INTRON?A1991N/ALamivudine拉米夫定EPIVIR-HBV?1998雜交研究解決方案

1Adefovirdipivoxil阿德福韋酯HEPSERA?2002AmplicorMonitor2Entecavir恩替卡韋BARACLUDE?2005CobasAmplicor3Peginterferonalfa-2a聚乙二醇干擾素α-2aPEGASYS?2005CobasAmplicor4Telbivudine替比夫定TYZEKA?2006CobasAmplicor5Tenofovir替諾福韋VIREAD(HIV)Phase3CobasTaqMan6

INTRON?A(Interferonalfa-2b)[packageinsert]、Schering-PloughCorp、Kenilworth,NJ2、EPIVIR-HBV?(Lamivudine)[packageinsert]GlaxoSmithKline,ResearchTrianglepark,NC3、HEPSERA?(Adefovirdipivoxil)[packageinsert]GileadSciences、FosterCity,CA4、Pegasys(Peginterferonalfa-2a)[packageinsert]、Hoffmann-LaRocheInc、Nutley,NJ5、TYZEKA?(Telbivudine)[PackageInsert]、NovartisPharmaceuticalsCorp、EHanover,NJ6、MarcellinPetal、HepDART2007MeetingAbstract63,Dec9-132007,Lahaina,HI國外發(fā)表得文獻Evaluationofinitialvirologicalresponsetoadefoviranddevelopmentofadefovir-resistantmutationsinpatientswithchronichepatitisB、Gallegoetal、,JournalofViralHepatitis,2008,15,392–398Evaluationofanautomated,highlysensitive,real-timePCR-basedassay(COBASAmpliprepTM/COBASTaqManTM)forquantificationofHCVRNA、ChristophSarrazinaetal、,JournalofClinicalVirology,2008,43,162–168COBASAmpliPrep-COBASTaqManHepatitisBVirus(HBV)Test:aNovelAutomatedReal-TimePCRAssayforQuantificationofHBVDNAinPlasma、TizianoAlliceetal、,JournalofClinicalMicrobiology,Mar、2007,p、828–834EvaluationoftheCOBASAmpliPrep-totalnucleicacidsolation-COBASTaqManhepatitisBvirus(HBV)quantitativetestandparisontotheVERSANTHBVDNA3、0assay、RonsinCetal、,JournalofClinicalMicrobiology2006vol、44(no、4)parisonoftheCOBASTaqManTMHBVTestWiththeCOBASAmplicorMonitorTMTestforMeasurementofHepatitisBVirusDNAinSerum、SimonSiu-ManSumetal、,JournalofMedicalVirology2005,77:486–490HepatitisBvirus(HBV)genotypedeterminationbytheCOBASAmpliPrep/COBASTaqManHBVTest,v2、0inserumandplasmamatrices、GoedelSetal、,JournalofClinicalVirology2009Jul;45(3):232-6parisonofVersantHBVDNA3、0andCOBASAmpliPrep-COBASTaqManassaysforhepatitisBDNAquantitation:Possibleclinicalimplications、GARBUGLIAA、R、etal、,Journalofvirologicalmethods2007,vol、146,no1-2,pp、274-280PerformanceoftheCobasAmpliPrep/CobasTaqManReal-TimePCRAssayforHepatitisBVirusDNAQuantification、Ste′phaneChevaliezetal、,JournalofClinical,May2008,p、1716–1723……HBV得定量檢測性能指標國產(chǎn)HBV試劑CAP/CTMHBV靈敏度(LOD)500IU/mL？12IU/mL檢測范圍104～5×107IU/mL54-1、1×108IU/mL定量方法外標法定量內(nèi)標法定量其她對部分發(fā)生HBV病毒突變得病人無法準確檢測涵蓋亞型:A-G加強pre-core突變檢測注:國產(chǎn)試劑1IU/mL=1copy/mLHCV得定量檢測性能指標國產(chǎn)HCV試劑CAP/CTMHCV靈敏度(LOD)500IU/mL？15IU/mL檢測范圍104～5×107IU/mL43–6、9×107IU/mL定量方法外標法定量內(nèi)標法定量其她未知1-6型(能區(qū)分0、5log濃度變化)定量原理

外標法定量(國產(chǎn)試劑)使用一組(4管)外部標準品定量,分別為5×104到5×107IU/mL未考慮各患者血液成分間得差異性對結果得影響定量原理

內(nèi)標定量InternalQuantitationStandard(CAP/CTM)內(nèi)標就是已知拷貝數(shù)得人工構建核酸,加入每一反應管,與靶核酸競爭擴增,管內(nèi)定量可提示反應就是否存在反應抑制,避免假陰性結果充分考慮管間反應效率得差異,得到可靠精確得結果COBASA