靶向蛋白降解技術(shù)的發(fā)展 2024

靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)和新一代降解劑處于研發(fā)風(fēng)口。本文匯總?cè)苊阁w和蛋白酶體途徑的多種創(chuàng)新降解技術(shù)。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解長(zhǎng)久以來(lái)的研究讓我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成有了比較全面的了解。關(guān)于細(xì)胞內(nèi)蛋白如何降解，以及降解對(duì)細(xì)胞調(diào)節(jié)的作用，其研究歷史相對(duì)較短。目前已知蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的半衰期從幾分鐘到幾天不等，蛋白質(zhì)降解速率的差異對(duì)細(xì)胞調(diào)節(jié)有重大影響。轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)節(jié)蛋白會(huì)降解，而細(xì)胞增殖相關(guān)的其他蛋白則會(huì)因特定信號(hào)而分解，錯(cuò)誤蛋白會(huì)被識(shí)別并清除，以避免對(duì)細(xì)胞造成損害1。真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)降解有兩條主要途徑：泛素-蛋白酶體途徑和溶酶體蛋白水解途徑1。對(duì)蛋白質(zhì)泛素標(biāo)記及其通過(guò)蛋白酶體周期性降解的發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著人們認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)降解劑對(duì)細(xì)胞整體平衡的重要性。除蛋白酶體外，溶酶體也是許多蛋白質(zhì)的“終點(diǎn)”（圖1）。這些膜結(jié)合細(xì)胞器在細(xì)胞新陳代謝中發(fā)揮作用，其中包括降解通過(guò)內(nèi)吞作用攝取的細(xì)胞外蛋白質(zhì)以及穩(wěn)定更替細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器。通往溶酶體的途徑多種多樣。自噬是其中一種，在此過(guò)程中，自噬體將目標(biāo)蛋白包裹起來(lái)，這些與膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)最終與溶酶體融合，以確保降解進(jìn)行。另外還有內(nèi)吞作用和吞噬作用，這些過(guò)程會(huì)將較大的顆粒吞入囊泡中，隨后囊泡與溶酶體融合，進(jìn)行降解。對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解途徑和能力的研究成果已被用于治療和藥物研發(fā)。小分子誘導(dǎo)的靶向蛋白質(zhì)降解為精確控制異常蛋白水平提供了機(jī)會(huì)。去除受損細(xì)胞器或其他分子的降解技術(shù)正在研究中。下文聚焦靶向蛋白降解和新型降解劑的研究進(jìn)展，簡(jiǎn)述其在不同疾病領(lǐng)域的應(yīng)用。人們對(duì)細(xì)胞運(yùn)作機(jī)制的了解不斷加深，推動(dòng)了藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的進(jìn)一步創(chuàng)新。靶向蛋白質(zhì)降解的幾種類型靶向蛋白質(zhì)降解為稱作“降解劑”的小分子物質(zhì)從細(xì)胞中清除疾病相關(guān)蛋白提供了多種可能2,3。這種技術(shù)可用于消滅細(xì)胞中的異常蛋白，包括很多曾經(jīng)被認(rèn)為不可成藥的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。此前，對(duì)靶向蛋白質(zhì)降解的研究主要集中于最終在蛋白酶體中被分解的疾病相關(guān)蛋白。在創(chuàng)新技術(shù)的驅(qū)動(dòng)下，降解其他疾病靶標(biāo)（包括DNA/RNA分子、蛋白質(zhì)聚集體、過(guò)氧化物酶體、核糖體、受損線粒體，乃至微生物病原體）的新方法正在涌現(xiàn)4。研究轉(zhuǎn)向溶酶體等新的細(xì)胞內(nèi)蛋白“終點(diǎn)站”，為藥物發(fā)現(xiàn)開(kāi)辟了更多可能蛋白酶體和溶酶體降解的區(qū)別在靶向降解蛋白質(zhì)領(lǐng)域，PROTACs和分子膠一直是研究的熱點(diǎn)2,3,5。這兩種降解劑都是利用泛素-蛋白酶體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的靶向降解（圖2）。在PROTACs和分子膠研究的啟發(fā)下，不斷有新型降解劑進(jìn)入我們的視線，這些降解劑可利用內(nèi)吞作用和自噬將更多靶標(biāo)送入溶酶體，以分解疾病相關(guān)蛋白（圖3）。以蛋白酶體或溶酶體為終點(diǎn)，小分子靶向降解可通過(guò)多種不同途徑實(shí)現(xiàn)（圖4）。隨著新技術(shù)的發(fā)展，降解劑的范圍從細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白和膜蛋白擴(kuò)展到核酸、功能失調(diào)的細(xì)胞器、傳染性有機(jī)體、細(xì)胞外蛋白、脂滴甚至聚集蛋白等新領(lǐng)域。這些進(jìn)展有望為包括但不限于癌癥、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病在內(nèi)的多種疾病帶來(lái)新的治療機(jī)會(huì)。1泛素-蛋白酶體系統(tǒng)靶向蛋白降解嵌合體(proteolysistargetingchimeras,PROTACs)是最有名的一類靶向蛋白質(zhì)降解劑2。PROTACs是一種雙功能分子，由兩個(gè)基本組成部分：一個(gè)是負(fù)責(zé)與目標(biāo)蛋白結(jié)合的配體，另一個(gè)是E3泛素連接酶配體，負(fù)責(zé)募集E3配體酶。被募集的連接酶將目標(biāo)蛋白質(zhì)帶到泛素-蛋白酶體系統(tǒng)附近，使其在那里被降在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域，研究人員正在探索多種方法，來(lái)推進(jìn)PROTACs在靶向蛋白質(zhì)降解方面的應(yīng)用。目前，多種PROTACs已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，這凸顯了靶向蛋白質(zhì)降解為未滿足的醫(yī)療需求提供新解決方案的潛力。早期候選藥物大多針對(duì)各種形式的癌癥，如今在其他疾病領(lǐng)域的新應(yīng)用正在穩(wěn)步增加。分子膠分子膠是一類小分子，也能通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)促進(jìn)靶向蛋白質(zhì)降解。分子膠與連接酶（最常見(jiàn)）或相關(guān)蛋?質(zhì)結(jié)合，沒(méi)有連接分子，這是與PROTACs的區(qū)別。由于沒(méi)有連接分子，分子膠的分子量更小，其細(xì)胞滲透性和生物利用度比PROTACs更高2。與藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)中使用的傳統(tǒng)占位驅(qū)動(dòng)抑制劑相比，分子膠可為靶向蛋白質(zhì)降解提供更持久的效果、更強(qiáng)的毒性和更高的藥效，而且不易引發(fā)耐藥性2。2溶酶體系統(tǒng)如前所述，新型降解劑可以通過(guò)內(nèi)吞和自噬功能，利用溶酶體來(lái)終結(jié)更多目標(biāo)物（圖2B，圖4）6。溶酶體是真核細(xì)胞中的一種膜結(jié)合細(xì)胞器，是控制細(xì)胞內(nèi)大分子降解的場(chǎng)所。溶酶體含有多種水解酶，能夠分解各種大分子，包括蛋白質(zhì)、脂類、核酸和碳水化合物。因此，新一代降解劑超越泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，利用將更多目標(biāo)物送入溶酶體的細(xì)胞途徑。溶酶體可以說(shuō)是細(xì)胞的“垃圾處理系統(tǒng)”，與蛋白酶體相比，可以處理更多的大分子。溶酶體中的降解酶在酸性條件下發(fā)揮最佳功能，這種環(huán)境由溶酶體膜上的質(zhì)子泵維持。因此，酸性環(huán)境對(duì)溶酶體水解酶的高效多種溶酶體途徑為靶向降解多種異常蛋白提供了創(chuàng)新空間。大多數(shù)新一代降解劑都通過(guò)核內(nèi)體-溶酶體途徑或自噬-溶酶體途徑發(fā)揮作用。接下來(lái)，我們將介紹這兩種途徑以及相對(duì)應(yīng)的一些新興降解劑。核內(nèi)體-溶酶體途徑核內(nèi)體是真核細(xì)胞中的膜結(jié)合細(xì)胞器，在細(xì)胞內(nèi)分子的分類、處理和輸送中發(fā)揮著重要作用。核內(nèi)體是內(nèi)細(xì)胞途徑的一部分，通過(guò)形成囊泡將細(xì)胞外物質(zhì)內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)（圖2B）。核內(nèi)體與溶酶體和高爾基體等其他細(xì)胞器協(xié)調(diào)運(yùn)作。一些新型降解劑可通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并通過(guò)核內(nèi)體-溶酶體途徑到達(dá)溶酶體，在溶酶體中將輸送目標(biāo)蛋白降解。從理論上講，這為降解大多數(shù)細(xì)胞外蛋白和膜蛋白提供了途徑，這些蛋白質(zhì)加起來(lái)約占蛋白質(zhì)組的40%6,7。溶酶體靶向嵌合體(lysosome-targetingchimaeras,LYTACs)可能是最有名的核內(nèi)體-溶酶體降解劑。LYTACs可以結(jié)合膜蛋白（或細(xì)胞外蛋白）的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞表面的溶酶體靶向受體（也稱溶酶體穿梭受體，LTR；見(jiàn)圖5）。三元復(fù)合物形成后，蛋白質(zhì)通過(guò)凝集素介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化。GlueTACsGlueTACs（GlueTargetedChimeras）是另一種核內(nèi)體-溶酶體降解劑，可以靶向細(xì)胞表面蛋白。GlueTACs結(jié)合納米抗體、抗原以及細(xì)胞穿透肽和溶酶體分選序列（CPP-LSS）的使用，以促進(jìn)靶標(biāo)的內(nèi)化和溶酶體降解。納米抗體取代了傳統(tǒng)抗體，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穿透。納米抗體和抗原通過(guò)共價(jià)相互作用來(lái)克服低結(jié)合親和力。GlueTACs還處于早期開(kāi)發(fā)階段，目前正在進(jìn)行進(jìn)一步研究，以全面確定其作用機(jī)AbTACs基于抗體的PROTACs（Antibody-basedPROTACs簡(jiǎn)稱AbTACs，是一種新興的核內(nèi)體-溶酶體降解劑，可作用于細(xì)胞外或膜蛋白。雖然名字中包含“PROTAC”，但AbTACs與LYTACs更為相似。AbTAC利用的是雙特異性抗體。其中一個(gè)抗體臂靶向細(xì)胞表面的目標(biāo)蛋白；另一個(gè)抗體臂靶向跨膜E3連接酶。AbTACs分子誘導(dǎo)“貨物”內(nèi)化，隨后在溶酶體中降解目標(biāo)蛋白質(zhì)。目前正在進(jìn)一步研究其確切的作用機(jī)制，包括泛素化步驟的細(xì)節(jié)。自噬-溶酶體途徑自噬是涉及細(xì)胞成分（包括受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)）降解和再循環(huán)的一種細(xì)胞過(guò)程，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)或有效運(yùn)作所必需的?！癮utophagy”一詞源于希臘語(yǔ)，意為“自我吞噬”，反映了細(xì)胞吞噬和降解自身成分的方式（圖2B）。當(dāng)吞噬泡包裹住細(xì)胞內(nèi)容物時(shí)，自噬過(guò)程啟動(dòng)。吞噬泡將“貨物”封閉，形成雙層膜包裹的自噬體囊泡，囊泡與溶酶體融合，釋放內(nèi)容物進(jìn)行降解6。AUTACsAUTACs(AUtophagy-TArgetedChimeras)是一種自噬-溶酶體降解劑，由三部分組成：基于cGMP的降解標(biāo)簽、連接分子，以及適合目標(biāo)蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的小分子配體。cGMP降解標(biāo)簽基于核苷酸8-硝基環(huán)鳥(niǎo)苷單磷酸，是細(xì)胞內(nèi)的一種信號(hào)通路分子，可以募集自噬體（圖2A）。自噬體除了能降解細(xì)胞蛋白質(zhì)外，還能降解線粒線粒體功能障礙與多種與年齡相關(guān)的疾病和其他疾病有關(guān)，清除受損細(xì)胞器是滿足臨床需求的一種有吸引力的策略。AUTACs除了降解目標(biāo)蛋白本身外，還具有降解蛋白質(zhì)聚集物的功能，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。ATTECs自噬小體綁定化合物(AutophagosomeTetheringCompounds,ATTECs)也是一種自噬-溶酶體降解劑，可將目標(biāo)蛋白綁住或連接到自噬體（圖6）8。ATTEC與LC3結(jié)合，LC3是酵母Atg8（自噬相關(guān)蛋白8）在哺乳動(dòng)物中的同源物，也是自噬體特有的關(guān)鍵蛋白。自噬體是雙層膜囊泡，包含要被降解的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)。在自噬過(guò)程中，自噬體與溶酶體融合形成自溶酶體（圖6）。融合過(guò)程使溶酶體酶降解自噬體的內(nèi)容物，包括在ATTEC作用下與LC3結(jié)合的任何目標(biāo)蛋白質(zhì)。也有研究指出ATTEC以脂滴為靶標(biāo)。一些小分子ATTEC既能結(jié)合LC3蛋白，也能結(jié)合脂滴。因此，ATTEC也可利用自噬-溶酶體途徑降解非蛋白質(zhì)物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，ATTEC能夠識(shí)別突變亨廷頓蛋白，特別是導(dǎo)致亨廷頓病的缺陷蛋白的多聚谷氨酰胺區(qū)段，有望成為治療神經(jīng)退行性疾病的新方法。AUTOTACs(AUTOphagy-TArgetingChimera)也能將特定蛋白質(zhì)募集到自噬體，最終在溶酶體內(nèi)降解。AUTOTACs與p62和目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。p62（又稱SQSTM1）是多泛素化“貨物”和自噬體之間的橋梁。p62蛋白是一種多功能蛋白，參與包括選擇性自噬在內(nèi)的多種細(xì)胞過(guò)程。p62包含多個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作?域，使其能夠與泛素化“貨物”和LC3（參與ATTECs機(jī)制的相同蛋白）相互作用。因此，添加AUTOTACs可以將目標(biāo)蛋白與p62連接起來(lái)，這種連接方式與目標(biāo)蛋白質(zhì)上的泛素?zé)o關(guān)。ATTEC分子同時(shí)結(jié)合LC3和目標(biāo)蛋白，AUTOTACs是結(jié)合p62和目標(biāo)蛋白，但LC3結(jié)合是在p63發(fā)生構(gòu)象變化后的下一步。技術(shù)發(fā)展對(duì)PROTAC和分子膠的研究已經(jīng)積累數(shù)十年。靶向蛋白質(zhì)降解劑的新技術(shù)，以及利用不同降解途徑的方法，乃至降解細(xì)胞中更大成分（包括有缺陷的細(xì)胞器）的方法也在不斷出現(xiàn)。2004年，AaronCiechanover、AvrimHershko和IrwinRose因發(fā)現(xiàn)泛素調(diào)控蛋白降解獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)時(shí)蛋白質(zhì)如何分解還沒(méi)有受到太多關(guān)注。蛋白質(zhì)泛素標(biāo)記及其在蛋白酶體中周期性降解的發(fā)現(xiàn)，不僅加深了人們對(duì)細(xì)胞分裂、DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和免疫學(xué)等過(guò)程的理解，還強(qiáng)化了這樣一種觀點(diǎn)，即通過(guò)研究細(xì)胞的原生降解系統(tǒng)可以獲得有用的藥物。目前，臨床試驗(yàn)中的大多數(shù)靶向蛋白質(zhì)降解劑都用于治療癌癥?，F(xiàn)有方法和新方法的擴(kuò)展為治療神經(jīng)退行性疾病、炎癥和自身免疫性疾病、病毒感染等疾病帶來(lái)了巨幾乎每天都有新的靶向降解概念出現(xiàn)6。靶向蛋白質(zhì)降解和更多創(chuàng)新型靶向降解劑的領(lǐng)域正在迅速擴(kuò)大，新的名稱也在不斷涌現(xiàn)。如圖3所示，與PROTACs和分子膠提供的靶向蛋白質(zhì)降解方案相比，ATTECs、AUTACs、LYTACs、AbTACs、GlueTACs和AUTOTACs都是新生力量。這些令人期待的新技術(shù)還在起步階段，有廣闊的發(fā)展前景。酶標(biāo)儀在降解劑研究中的作用酶標(biāo)儀是助力蛋白質(zhì)降解研究的多功能工具，能夠以經(jīng)濟(jì)高效的方式監(jiān)測(cè)從靶標(biāo)結(jié)合到降解的整個(gè)過(guò)程。先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)有助于提高通量，簡(jiǎn)化手動(dòng)操作，從而高效篩選降解劑候選物。BMGLABTECH致力于滿足這一研究領(lǐng)域的現(xiàn)有和未來(lái)需求，為攻克此前不可成藥的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)擴(kuò)展機(jī)會(huì)。BMGLABTECH提供一系列涵蓋吸收光、熒光和化學(xué)發(fā)光測(cè)量的靈敏檢測(cè)設(shè)備。那么對(duì)于與降解劑研究相關(guān)的特定需求和應(yīng)用，哪種酶標(biāo)儀更適合？其中PHERAstarFSX專為篩選而設(shè)計(jì)，在降解劑研究中，是高性能高通量檢測(cè)的首VANTAstar?和CLARIOstarPlus均支持波長(zhǎng)掃描，并采用動(dòng)態(tài)范圍擴(kuò)展技術(shù)，單次運(yùn)行即可提供高質(zhì)量數(shù)據(jù)。配備線性可變?yōu)V光片光柵TM和多種濾光片選擇，可提高透光率和靈敏度。對(duì)于活細(xì)胞檢測(cè)，還可配備大氣控制單元。BMGLABTECH的酶標(biāo)儀都具有超快的讀取能力。Omega系列、CLARIOstar