DB23T 3767-2024奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.30CCSB44232024-08-30發(fā)布IDB23/T3767—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院。本文件主要起草人：鄭家三、劉云、邵廣、張鶴飛、周志新、葛延松、徐恩爽、韓歡勝、王崢、孫悅、楊春雪、田雪。DB23/T3767—2024近年來，在市場和政策的推動下，以及地處北緯43～53°世界公認的黃金“奶牛帶”這一得天獨厚的資源優(yōu)勢，黑龍江省奶牛規(guī)模養(yǎng)殖發(fā)展速度迅速，隨之而來的是一些奶牛群發(fā)生產(chǎn)疾病特別是奶牛肢蹄病的發(fā)病率呈上升趨勢，對我省奶牛養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展造成了巨大的威脅。在奶牛肢蹄病中蹄病發(fā)病率約占90%以上，根據(jù)表現(xiàn)形式可分為感染性和非感染性兩類，常見的感染性蹄病主要包括腐蹄病、蹄趾皮炎和趾間皮炎等，奶牛蹄病一直是困擾奶牛健康養(yǎng)殖的難題，深入闡明奶牛蹄病的病原易感性及其炎癥發(fā)生機制是十分必要的。以往對奶牛蹄部感染性疾病的研究往往采用活體實驗，不僅給實驗帶來諸多不便，而且實驗成本高昂，更重要的是違背動物福利原則，因此尋找一種可替代的離體實驗?zāi)Ｐ途哂兄匾默F(xiàn)實意義，基于以上目的，本文件提出構(gòu)建奶牛趾間皮膚外植體。3DB23/T3067—2024奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了奶牛趾間皮膚外植體的來源、采樣、構(gòu)件材料、活性檢測方法、構(gòu)建成功評定方法的要求。本文件適用奶牛趾間皮膚外植體的構(gòu)建。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB16568-2006奶牛場衛(wèi)生規(guī)范DB2306/T096-2019《奶牛蹄部疾病診斷技術(shù)規(guī)程》DB23/T1618-2015奶牛蹄保健技術(shù)規(guī)范DB61/T367.16-2022荷斯坦牛生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范第16部分：肢蹄病防治GB/T27830-2011化學(xué)品體外皮膚腐蝕人體皮膚模型試驗方法SN/T4577-2016化妝品皮膚刺激性檢測重建人體表皮模型體外測試方法JY0315-1991皮膚結(jié)構(gòu)模型技術(shù)條件3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1皮膚外植體從活體動物切取下來進行培養(yǎng)的皮膚組織。4要求4.1外植體皮膚來源要求4.1.1以新屠宰的奶牛后蹄趾間皮膚為外植體皮膚來源。4.1.2外植體所用的皮膚需從無蹄部疾病且蹄型結(jié)構(gòu)良好的奶牛后蹄蹄叉處采集。4.2人員要求4.2.1具有扎實的獸醫(yī)外科專業(yè)知識，且熟練掌握獸醫(yī)外科手術(shù)操作技能。4.2.2熟練掌握組織/細胞培養(yǎng)技術(shù)。4.2.3熟練掌握病理組織學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)并具有分析病理組織切片的能力。4.3采樣要求4DB23/T3067—20244.3.1使用的外科手術(shù)器械應(yīng)經(jīng)過嚴格消毒、滅菌。4.3.2樣品采集過程保證無菌操作。5奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建材料5.1主要材料奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建所用耗材見附錄A。5.2主要設(shè)備奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建所用主要設(shè)備見附錄B。5.3奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建方法5.3.1培養(yǎng)基配制5.3.1.1運輸培養(yǎng)基每100mL運輸培養(yǎng)基中，含有青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液（100×)1mL、L-谷氨酰胺溶液1mL、5μg/mL硫酸慶大霉素9μL，余量為DMEM/F121:1培養(yǎng)基。5.3.1.2洗滌培養(yǎng)基每100mL洗滌培養(yǎng)基中，含有青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液（100×)1mL、2μg/mL硫酸慶大霉素4μL，余量為DMEM/F121:1培養(yǎng)基。5.3.1.3組織培養(yǎng)基每100mL洗滌培養(yǎng)基中，含有青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液（100×)1mL、L-谷氨酰胺溶液1mL、5μg/mL硫酸慶大霉素10μL，胎牛血清10mL，DMEM高糖培養(yǎng)基65.993mL，余量為DMEM/F-121:1培養(yǎng)基。5.3.2樣本的采集選取無蹄部疾病且蹄型結(jié)構(gòu)良好的新屠宰奶牛。首先用刷子對蹄部表面進行刷洗，流水沖洗直至表面無糞便、泥土等污物附著，然后用2%葡萄糖鹽酸氯己定沖洗蹄部8～10次，隨后用75%酒精擦拭過的電推剪除去奶牛趾間皮膚被毛，用無菌手術(shù)刀片刮凈殘留毛發(fā)，75%酒精噴洗奶牛趾間皮膚8～10次后，使用8.0mm皮膚打孔器收集奶牛蹄部趾間皮膚。5.3.3運輸將收集到的奶牛趾間皮膚放入一次性無菌培養(yǎng)皿中，加入含有1%青霉素-鏈霉素的PBS磷酸緩沖溶液中，反復(fù)洗滌至沒有血液后，立即放入裝有運輸培養(yǎng)基的容器中，隨后放入裝有冰袋的保溫箱中運輸回實驗室。5.3.4奶牛趾間皮膚外植體的組裝5.3.4.1將裝有奶牛趾間皮膚的容器放入滅菌后的超凈工作臺上，取出奶牛趾間皮膚，使用無菌手術(shù)剪去除趾間皮膚多余的皮下脂肪，75%酒精涮洗3次，然后浸入預(yù)熱至37℃的洗滌培養(yǎng)基中洗滌3次，每次洗滌時間為15min。5DB23/T3067—20245.3.4.2取500μL體積分數(shù)為1.2%的瓊脂糖置于12孔培養(yǎng)板最下層作為底座，目的是為奶牛趾間皮膚外植體提供物理支撐，在其上覆蓋0.5cm2無菌手術(shù)紗布，將洗滌后的奶牛趾間皮膚置于紗布之上5.3.4.3在12孔培養(yǎng)板內(nèi)添加組織培養(yǎng)基至奶牛趾間皮膚的表皮與真皮交界處，形成氣相與液相交替的培養(yǎng)系統(tǒng)。將組裝的奶牛趾間皮膚外植體置于37℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12h更換1次培養(yǎng)基。5.3.4.4按照本方法組裝的奶牛趾間皮膚外植體培養(yǎng)24h時表皮結(jié)構(gòu)完整，真皮層膠原纖維排列緊密，未見明顯病理變化，可用于體外研究，體外模型構(gòu)建成功。5.3.5奶牛趾間皮膚外植體活性檢測及構(gòu)建成功的評定方法奶牛趾間皮膚外植體活性檢測及構(gòu)建成功的評定方法見附錄C。圖1皮膚趾間皮膚外植體模型組裝圖6DB23/T3067—2024奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建材料奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建材料見表A.1。表A.1奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建材料7DB23/T3067—2024奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建主要設(shè)備奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建主要設(shè)備見表A.2。表A.2奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建主要設(shè)備8DB23/T3067—2024（資料性）奶牛趾間皮膚外植體活性檢測及構(gòu)建成功的評定方法C.1奶牛趾間皮膚外植體活性檢測C.1.1HE染色法檢測奶牛趾間皮膚外植體病理變化C.1.1.1皮膚組織切片制作按上述文件外植體的構(gòu)建方法培養(yǎng)0、12、24、36、48和72h后收集奶牛趾間皮膚外植體，固定于4%多聚甲醛中。將經(jīng)過甲醛固定的奶牛趾間皮膚外植體經(jīng)流水沖洗4h后，分別在75%、85%、95%、100%酒精中浸泡1h進行脫水處理，在二甲苯中浸泡1h30min進行透明處理，最后在65℃浸蠟1h30min進行包埋，包埋好的組織塊即可按需要制作石蠟組織切片。C.1.1.2HE染色按照HE染色試劑盒說明書的步驟進行染色，封片后顯微鏡下觀察組織切片，檢測奶牛趾間皮膚外植體病理變化。C.1.2Caspase-3蛋白表達檢測C.1.2.1皮膚組織切片制作同C.1.1.1。C.1.2.2免疫組化C.1.2.2.1caspase-3是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要成員之一，在細胞凋亡早期被激活。FasL與靶細胞表面的Fas結(jié)合后通過Fas分子胞內(nèi)段的死亡結(jié)構(gòu)域激活caspase-8，引起caspase酶級聯(lián)反應(yīng)，最后激活內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶，誘導(dǎo)靶細胞的凋亡；顆粒酶通過靶細胞細胞膜上穿孔素形成的小孔進入細胞內(nèi)，激活caspase-10，也能引起caspase酶級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)靶細胞的凋亡；線粒體損傷時，位于線粒體內(nèi)膜和外膜間的細胞色素c會被釋放到細胞質(zhì)中，與Apaf-1結(jié)合，繼而激活caspase-9，引起caspase酶級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)靶細胞的凋亡。由caspase-8、caspase-10和caspase-9啟動的caspase酶級聯(lián)反應(yīng)都需要首先經(jīng)過caspase-3傳導(dǎo)凋亡信號。所以，可以通過檢測caspase-3活化的來證明發(fā)生細胞凋亡。C.1.2.2.2按照SP檢測試劑盒說明書的步驟對組織切片進行免疫組織化學(xué)染色，封片后顯微鏡下觀察，對奶牛趾間皮膚外植體中Caspase-3凋亡蛋白的陽性表達進行檢測。選取不同培養(yǎng)時期皮膚組織切片高倍（400×)視野各3張，使用Fiji/ImageJ-win64軟件對視野下的陽性細胞和總細胞進行計數(shù)，并根據(jù)公式陽性率＝陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%，計算陽性率。C.1.3TUNEL細胞凋亡檢測C.1.3.1皮膚組織切片制作同C.1.1.1。9DB23/T3067—2024C.1.3.2TUNEL染色C.1.3.2.1TUNEL染色法是通過識別發(fā)生斷裂DNA末端游離的3'-OH檢測細胞凋亡的免疫組化技術(shù)，因其操作簡單、應(yīng)用范圍廣泛及檢測結(jié)果靈敏等特點已成為實驗室、動物模型和臨床研究中檢測細胞凋亡的首選方法。C.1.3.2.2按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書的步驟對組織切片進行染色，隨后封片顯微鏡下觀察，對奶牛趾間皮膚外植體中細胞凋亡的陽性表達進行檢測。選取不同培養(yǎng)時期皮膚組織切片高倍（400×)視野各3張，使用Fiji/ImageJ-win64軟件對視野下的陽性細胞和總細胞進行計數(shù)，并根據(jù)公式陽性率＝陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%，計算陽性率。C.2奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建成功評定方法C.2.1奶牛趾間皮膚外植體病理變化HE染色結(jié)果如圖C.1所示，對照組0h皮膚組織的表皮完整，各層結(jié)構(gòu)清晰可見；真皮層的結(jié)締組織排列規(guī)則；肌層的肌纖維緊密排列，毛囊、皮脂腺及汗腺等散在分布，真皮層中可見少量的淋巴細胞（C.1（a））。與之相比試驗組各培養(yǎng)時期皮膚組織的表皮層均發(fā)生不同程度角化過度，真皮層膠原纖維紊亂并伴有不同程度中性粒細胞浸潤等病理變化，除72h皮膚組織表現(xiàn)為中度炎癥反應(yīng)外，其余均表現(xiàn)為輕度炎癥反應(yīng)。12h和24h皮膚組織的表皮結(jié)構(gòu)完整，真皮層膠原纖維排列緊密，無明顯病理變化（圖C.1（b）和（c36h皮膚組織角質(zhì)層呈網(wǎng)籃狀，偶見上皮細胞變性（圖C.1（d48h皮膚組織可觀察到大量上皮細胞變性及少量上皮細胞壞死，同時伴隨細胞核固縮（圖C.1（e72h皮膚組織可見表皮脫落、缺失，毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器官發(fā)生程度不同的壞死（圖C.1（f。HE染色結(jié)果表明，奶牛趾間皮膚外植體在培養(yǎng)24h組織結(jié)構(gòu)完整，并未出現(xiàn)明顯病理變化；培養(yǎng)36h出現(xiàn)細胞凋亡早期的變性跡象，提示此時已不適用于體外研究。標(biāo)引序號說明：a～f依次為0、12、24、36、48及72h奶牛趾間皮膚外植體；藍色箭頭所指：真皮層淋巴細胞浸潤；DB23/T3067—2024黑色箭頭所指：表皮層角化過度；紅色箭頭所指：毛囊、汗腺、皮脂腺壞死；綠色箭頭所指：細胞變性、壞死，細胞核固縮。圖C.1奶牛趾間皮膚外植體病理變化（HE×200）C.2.2奶牛趾間皮膚外植體Caspase-3蛋白表達情況免疫組化結(jié)果如圖C.2所示，對照組0h奶牛趾間皮膚外植體中可見輕微的Caspase-3蛋白陽性表達；試驗組12、24、36、48和72h奶牛趾間皮膚外植體表皮及真皮中Caspase-3蛋白明顯呈陽性表達，根據(jù)分布情況可知，表皮中Caspase-3蛋白陽性表達情況高于真皮；體外培養(yǎng)72h內(nèi)奶牛趾間皮膚外植體凋亡細胞數(shù)量從0.86%上升至46.96%，說明體外培養(yǎng)時間越長，細胞凋亡陽性率越高。免疫組化結(jié)果表明，體外培養(yǎng)時間越短，細胞凋亡陽性率越低，結(jié)合HE染色結(jié)果，確定奶牛趾間皮膚外植體培養(yǎng)24h是體外研究的最佳時間。標(biāo)引序號說明：a～f依次為0、12、24、36、48及72h奶牛趾間皮膚外植體；黃色為DAB顯色下Caspase-3蛋白陽性表達細胞。圖C.2奶牛趾間皮膚外植體Caspase-3蛋白表達（DAB×400）C.2.3奶牛趾間皮膚外植體凋亡細胞表達情況TUNEL染色結(jié)果如圖C.3所示，對照組0h奶牛趾間皮膚外植體可見少量細胞發(fā)生凋亡；試驗組12、24、36、48和72h的奶牛趾間皮膚外植體表皮和真皮中凋亡細胞呈明顯陽性表達，根據(jù)分布情況可知，表皮中凋亡細胞數(shù)量高于真皮；細胞凋亡陽性率