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DB34DB34/T3307—2018分子標(biāo)記輔助選擇抗稻瘟病基因Pi1、Pi2Protocolformolecularmarkerassisted-selectionofriceblastresistancegenePi1andPi2PCRmethod2018-12-29發(fā)布2019-01-29實施安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I1分子標(biāo)記輔助選擇抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的檢測PCR法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了分子標(biāo)記輔助選擇抗稻瘟病雙基因Pi1和Pi2的PCR檢測方法。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)CTAB:cetyltrimethylammoniumbromide,DNA:deoxyribonucleicaciddNTPs:deoxyribonucleosidetriphoPAGE:polyacrylamidegelelectrophoresis,聚PCR:polymerasechainreaction,聚合SSR:simplesequencere和Pi2緊密連鎖的分子標(biāo)記,以及適用于對連鎖標(biāo)記檢測結(jié)果進(jìn)行驗證和水稻品種中稻瘟病抗源基因的DNA,利用篩選的特異性檢測引物對樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,依據(jù)是否擴(kuò)增獲得預(yù)期大小的DNA2高壓滅菌鍋、超純水儀、高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋(30℃~100℃)、核酸蛋白測定儀、組織研磨去離子甲酰胺、溴酚藍(lán)、二甲苯青FF、丙烯酰胺、取待檢樣品的去殼種子、幼苗或葉片約200~300mg置于2.0mL離心管,充分研磨;每管700μL經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB提取液,充分混合,65℃水浴30mi棄上清液,用70%乙醇溶液洗滌2遍;室溫自然晾干后,加入超純水或T將種子發(fā)芽至幼苗長度達(dá)到3cm左右時剪取0.5cm長的幼苗,或?qū)⑻镩g植株的葉片剪取0.53本標(biāo)準(zhǔn)針對抗稻瘟病基因Pi1和Pi2分別篩選出兩對檢測引物(見表1),包括與抗稻瘟病基因表1檢測抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小Pi1Pi2擴(kuò)增產(chǎn)物加入2L上樣指示劑后于4℃保存。涂有剝離硅烷的一面朝下蓋于無凹槽玻璃板上,兩側(cè)對稱拔下玻璃板上的樣品梳,用清水洗凈點樣槽,再將玻璃板裝上電泳槽,上下槽4針對連鎖標(biāo)記兩重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測,若樣本量大(多于96個樣品),進(jìn)行兩道電泳,即每斷開電源,第二次點樣96個(包括兩個對照樣品),2000一次性可檢測96×2=192個不同樣品(含2×2=4個對照樣品)的抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的等位基出,在清水中漂洗1分鐘左右;最后取出膠板,晾干,放在膠片觀察燈下觀察,長度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,則可判斷檢測樣品中不含有相應(yīng)的抗稻瘟病基因;如可擴(kuò)增出與陽性對照物電泳譜帶與含有抗稻瘟病基因Pi1或Pi2的陽性對照相同時,基因型記為Pi1/Pi2純合導(dǎo)入,與陰性對照相同時,基因型記為Pi-1/Pi-2無導(dǎo)入,同時具有陽性對記為Pi1/Pi2雜合導(dǎo)入。明含有Pi1抗性基因;無擴(kuò)增產(chǎn)物的,證明不含Pi1抗性基因。用P的樣品,證明含有Pi2抗性基因;擴(kuò)增出不同片段長度產(chǎn)物的,證明不含Pi2抗性基因。5用TE緩沖液1(或超純水)分別配制正向A.3.140%PAGE膠6A.3.24%PAGE膠A.3.3親和硅烷工作液A.3.55×TBE緩沖液A.3.60.5×TBE緩沖液7原濃度終濃度體積ddH2O--10×Buffer10×1×1MgCl225mmol/L2.5mmol/L1dNTP2.5mmol/L0.2mmol/LTaq酶5U/L0.5UP1-1引物5mol/L0.25mol/LP2-1引物5mol/L0.25mol/LDNA2原濃度終濃度體積ddH2O--10×Buffer10×1×1MgCl225mmol/L2.5mm

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