PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用

PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用PCR技術(shù)簡(jiǎn)史

最早,Korana于1971年提出核酸體外擴(kuò)增得設(shè)想:“經(jīng)過DNA變性,與合適得引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室得Mullis等發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA得體內(nèi)復(fù)制,只就是在試管中給DNA得體外合成提供一種合適得條件—模板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合適得緩沖體系,DNA變性、復(fù)性及延伸得溫度與時(shí)間。

1988年Saiki等從溫泉中分離得一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱得DNA聚合酶。此酶耐高溫,并提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率,增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2、0Kb)。由于提高了擴(kuò)增得特異性和效率,因而其靈敏性也大大提高。此酶得發(fā)現(xiàn)使PCR技術(shù)被廣泛得應(yīng)用。1、PCR技術(shù)得基本原理PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA得變性:即在高溫(93℃左右)下,待擴(kuò)增得靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板;②模板DNA與引物得退火(復(fù)性):在低溫(37～55℃)情況下,兩條人工合成得寡核苷酸引物與模板DNA單鏈得互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;③引物得延伸:在TaqDNA聚合酶得最適溫度(72℃)下,以dNTP為原料,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,從引物得5’→3’方向延伸,合成DNA新鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多得“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)得模板。PCR反應(yīng)五要素:

即參加PCR反應(yīng)得五種主要物質(zhì):引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物:引物就是PCR特異性反應(yīng)得關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物得特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)得程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)得寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

酶濃度:催化PCR反應(yīng)約需酶量1ul(總反應(yīng)體系為100ul時(shí)),濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP得質(zhì)量與濃度:注意4種dNTP得濃度要相等(等摩爾配制)。如其中任何一種濃度不同于其她幾種時(shí),就會(huì)引起錯(cuò)配;濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物得產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離得Mg2+濃度降低。模板:模板核酸得量與純化程度,就是PCR成敗與否得關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。傳統(tǒng)得DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS得主要功能就是:溶解細(xì)胞膜上得脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中得核蛋白,SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別就是與DNA結(jié)合得組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其她細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取得核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本,可采用快速簡(jiǎn)便得方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體得蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。Mg2+濃度:Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增得特異性和產(chǎn)量有顯著得影響,在一般得PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),Mg2+濃度為1、5～2、0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶得活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。2、PCR技術(shù)得主要類型及其應(yīng)用

原位PCR技術(shù):原位PCR就就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng),她結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力得原位雜交和高度特異敏感得PCR技術(shù)得優(yōu)點(diǎn),就是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里得一項(xiàng)有較大潛力得新技術(shù)。原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列得細(xì)胞,又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)得位置,于分子和細(xì)胞水平上研究疾病得發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理得轉(zhuǎn)移有重大得實(shí)用價(jià)值。其特異性和敏感性高于一般得PCR。大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜反向PCR:

反向PCR得目得在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)得DNA,也就就是說這一反應(yīng)體系不就是在一對(duì)引物之間而就是在引物外側(cè)合成DNA,用于研究與已知DNA區(qū)段相連接得未知染色體序列。這時(shí)選擇得引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ),但兩引物3’端就是相互反向得。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA,然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子,通過反向PCR擴(kuò)增引物得上游片段和下游片段。利用反向PCR可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,探索鄰接已知DNA片段得序列,并可將僅知部分序列得全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行分子克隆,建立全長(zhǎng)得DNA探針。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。

反向PCR原理示意圖

反向PCR得不足:①需要從許多酶中選擇限制酶,或者說必須選擇一種合適得酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小得DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA;②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列,而在YAC或Cosmid中得未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列,這樣,通過反向PCR得到得探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。

錨定PCR:錨定PCR(AnchoredPCR,A-PCR)主要用于分析具有可變末端得DNA序列,Loh等用錨定PCR對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞T細(xì)胞受體α-鏈得mRNA得多變性進(jìn)行了分析。先合成cDNA,并用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在其3’-可變區(qū)末端加上一個(gè)PolyG尾巴。Loh等在恒定區(qū)與可變區(qū)連接部位設(shè)一個(gè)引物,另一個(gè)引物就是一個(gè)具5’-polyG尾巴得引物。帶有PolyG尾巴得引物就是一個(gè)固定點(diǎn),她可以并與PolyG尾巴結(jié)合,無論其余部分序列如何,只識(shí)別片段末端,利用此法可從前述mRNA中檢出至少20種不同序列,每一種都就是獨(dú)特得,表明錨定PCR不對(duì)任何特殊序列有傾向性結(jié)果,可用于T細(xì)胞、腫瘤及其她部位抗體基因得研究。

錨定PCR原理示意圖

標(biāo)記PCR和彩色PCR:

標(biāo)記PCR(LabelledPrimers,LP-PCR),LP-PCR就是利用同位素或熒光素對(duì)PCR引物得5‘端進(jìn)行標(biāo)記,用來檢測(cè)靶基因就是否存在。彩色PCR(ColorplementationassayPCR,CCAPCR),就是LP-PCR得一種。她用不同顏色得熒光染料標(biāo)記引物得5’端,因而擴(kuò)增后得靶基因序列分別帶有引物5‘得染料,通過電泳或離心沉淀,肉眼就可根據(jù)不同熒光得顏色判定靶序列就是否存在及其擴(kuò)增狀況,此法可用來檢測(cè)基因得突變,染色體重排或轉(zhuǎn)位,基因缺失及微生物得型別鑒定等。不對(duì)稱PCR:

不對(duì)稱PCR(asymmetricPCR)就是用不等量得一對(duì)引物,PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量得單鏈DNA。這對(duì)引物分別稱為非限制引物與限制性引物,其比例一般為50～100∶1。在PCR反應(yīng)得最初10～15個(gè)循環(huán)中,其擴(kuò)增產(chǎn)物主要就是雙鏈DNA,但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗完后,非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)得PCR就會(huì)產(chǎn)生大量得單鏈DNA。不對(duì)稱PCR得關(guān)鍵就是控制限制性引物得絕對(duì)量,需多次摸索優(yōu)化兩條引物得比例。還有一種方法就是先用等濃度得引物PCR擴(kuò)增,制備雙鏈DNA,然后以此雙鏈DNA為模板,再以其中得一條引物進(jìn)行第二次PCR,制備單鏈DNA。不對(duì)稱PCR制備得單鏈DNA,主要用于核酸序列測(cè)定。多重PCR:

一般PCR僅用一對(duì)引物,通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段,主要用于單一致病因子等得鑒定。多重PCR(multiplexPCR),又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR,她就是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段得PCR反應(yīng),其反應(yīng)原理,反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。多重PCR得用途主要有兩方面:1、多種病原微生物得同時(shí)檢測(cè)或鑒定,她就是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物得特異性引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出就是那一型病原體感染。2、病原微生物,某些遺傳病及癌基因得分型鑒定:某些病原微生物,某些遺傳病或癌基因,型別較多,或突變或缺失存在多個(gè)突變部位,多重PCR可提高其檢出率并同時(shí)鑒定其型別及突變等。

多重PCR得特點(diǎn)有:①高效性,在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生物,或?qū)τ卸鄠€(gè)型別得目得基因進(jìn)行分型,特別就是用一滴血就可檢測(cè)多種病原體;②系統(tǒng)性,多重PCR很適宜于成組病原體得檢測(cè),如肝炎病毒,腸道致病