熒光定量?jī)x介紹

熒光定量?jī)x介紹Rotor-Gene6000得升降溫示意圖。Rotor-Gene6000具有轉(zhuǎn)子式設(shè)計(jì)樣品以400rpm持續(xù)離心,防止樣品凝結(jié),除去氣泡,省去了反應(yīng)前離心步驟。樣品在空氣倉內(nèi)加熱和降溫。通過蓋上得鎳鉻線圈加熱。通過頂部氣孔將熱空氣排出,底部風(fēng)扇吹入冷空氣實(shí)現(xiàn)降溫。

Rotor-Gene6000光學(xué)系統(tǒng)示意圖。

可自選得6個(gè)激發(fā)光源和6片檢測(cè)濾鏡樣品由反應(yīng)倉底部得得發(fā)光二極管激發(fā)能量通過薄壁管底部激發(fā)染料發(fā)射熒光通過反應(yīng)倉側(cè)壁得發(fā)射濾鏡由光電倍增管收集光信號(hào)常用配件36-孔轉(zhuǎn)子 36-孔轉(zhuǎn)子壓環(huán) 72-孔轉(zhuǎn)子 72-孔轉(zhuǎn)子壓環(huán) Rotor支架 準(zhǔn)備一個(gè)反應(yīng)1、選擇轉(zhuǎn)子類型36孔轉(zhuǎn)子及壓環(huán),使用0、2ml得管子,在實(shí)驗(yàn)中最為常用。管子無需就是頂部透明得,因?yàn)闊晒庑盘?hào)就是由管底部檢測(cè)得?，F(xiàn)在同樣可以使用圓蓋得管子。

72孔轉(zhuǎn)子和壓環(huán),使用0、1ml得四聯(lián)管,她允許最小達(dá)5ul得反應(yīng)體積。她得蓋子提供了安全可靠得密封性準(zhǔn)備一個(gè)反應(yīng)2、反應(yīng)設(shè)置將反應(yīng)管插入樣品板、分裝試劑蓋好管蓋,確保蓋緊。準(zhǔn)備一個(gè)反應(yīng)將三針壓環(huán)固定在轉(zhuǎn)子上,壓環(huán)保證了反應(yīng)中蓋子與管子得緊密結(jié)合。反應(yīng)管插入相應(yīng)得轉(zhuǎn)子,確保每個(gè)管子都正確放置,可選配轉(zhuǎn)子支撐架以便于管子得放置。為了達(dá)到最大得溫度均一性,轉(zhuǎn)子中得每個(gè)孔都必需放置有管子。將插好管子得轉(zhuǎn)子固定在Rotor-Gene得中心轉(zhuǎn)軸上。軸上得位置指針保證轉(zhuǎn)子得正確安裝。要拆下轉(zhuǎn)子,只需推動(dòng)上部得轉(zhuǎn)子桿即可釋放轉(zhuǎn)子。設(shè)置一個(gè)運(yùn)行新得反應(yīng)可用快速啟動(dòng)進(jìn)行設(shè)置?？焖賳?dòng)向?qū)共僮髡吣軌虮M快得完成設(shè)置,開始一個(gè)反應(yīng),向?qū)?nèi)含有多個(gè)程序模板,她們包括了默認(rèn)得循環(huán)條件下及采集通道。第一步就是選擇一個(gè)運(yùn)行模板:PerformLastRun:從上一個(gè)反應(yīng)中導(dǎo)入循環(huán)設(shè)置、通道設(shè)置及樣品定義。ThreeStepwithMelt:三步法并運(yùn)行熔解曲線,信號(hào)采集為FAM/SYBR通道。TwoStep:雙標(biāo)記探針,默認(rèn)兩步法,信號(hào)采集為所有通道。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)設(shè)置一個(gè)運(yùn)行選擇轉(zhuǎn)子類型選中壓環(huán)已蓋緊得小框,以繼續(xù)向?qū)Р僮髟O(shè)置一個(gè)運(yùn)行可輸入操作者得名字及注釋信息必需輸入PCR反應(yīng)體積。反應(yīng)體積為20-25uL設(shè)置一個(gè)運(yùn)行修改溫度循環(huán)通道設(shè)置點(diǎn)擊EditProfile編輯鍵進(jìn)入編輯器以修改循環(huán)條件及選擇采集通道設(shè)置一個(gè)運(yùn)行流程編輯器在選中得循環(huán)后插入一個(gè)循環(huán)在選中得循環(huán)前插入一個(gè)循環(huán)從流程中刪除選中得循環(huán)設(shè)置一個(gè)運(yùn)行設(shè)定循環(huán)得重復(fù)數(shù)設(shè)定溫度/時(shí)間窗口中顯示了每一個(gè)循環(huán)點(diǎn)擊左側(cè)溫度和時(shí)間指示并進(jìn)行修改通過右側(cè)得+/-鍵進(jìn)行添加或刪除循環(huán)設(shè)置一個(gè)運(yùn)行采集可在循環(huán)中得任一步,任一個(gè)通道設(shè)置點(diǎn)擊NotAcquisition鍵。點(diǎn)擊后,會(huì)顯示采集窗口。設(shè)置一個(gè)運(yùn)行染料通道選擇表可以根據(jù)使用得染料找出相應(yīng)得通道要設(shè)置采集通道,只需將可用通道列表中得通道添加到采集通道中即可設(shè)置一個(gè)運(yùn)行完成設(shè)置后點(diǎn)擊Calibrate校正…鍵以進(jìn)入增益值校正窗口設(shè)置一個(gè)運(yùn)行自動(dòng)增益校正讓機(jī)器自動(dòng)進(jìn)行校正,直至所有選中得通道得熒光讀數(shù)都落在一個(gè)閾值范圍內(nèi);優(yōu)化所有/優(yōu)化采集:“優(yōu)化所有”將校正軟件所知得所有通道。選擇“優(yōu)化采集”將只校正該反應(yīng)中所用到得通道(循環(huán)和熔解);通道設(shè)置:這就是一個(gè)下拉式得菜單,允許您向增益值校正窗口中添加新得通道,選中需要得通道并點(diǎn)擊添加。設(shè)置一個(gè)運(yùn)行總結(jié)反應(yīng)得總體情況。確定參數(shù)設(shè)置。點(diǎn)擊StartRun開始反應(yīng)。設(shè)置一個(gè)運(yùn)行此時(shí)會(huì)彈出文件保存<Saveas>窗口該文件包括一次運(yùn)行得所有信息設(shè)置一個(gè)運(yùn)行當(dāng)反應(yīng)開始后,可以在等待反應(yīng)完成得這段時(shí)間里輸入樣品得類型及描述。這一界面得功能與樣品編輯器完全一致。您同樣也可以在反應(yīng)結(jié)束后對(duì)樣品進(jìn)行編輯。程序運(yùn)行后,可以在軟件界面上實(shí)時(shí)觀察到如下得窗口:顯示原始得熒光信號(hào)收集界面,溫度界面和反應(yīng)進(jìn)程界面,窗口右邊就是樣品信息欄。通過此界面可以實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR反應(yīng),反應(yīng)剩余時(shí)間,以及升降溫情況。原始得熒光信號(hào)收集界面溫度界面反應(yīng)進(jìn)程界面反應(yīng)完成后,可通過“Analysis”鍵,對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。選擇所需要得分析方法,如:定量分析,熔解曲線分析等之后,按<Show>鍵,則可以在窗口中看到相關(guān)圖表結(jié)果?！癘ther…”里有其她分析方法。parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介先對(duì)樣品中得目得基因與看家基因分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定兩個(gè)基因得擴(kuò)增效率就是否一致或接近,將擴(kuò)增效率優(yōu)化為一致;同一樣品分別進(jìn)行看家基因和目得基因得擴(kuò)增,分列在兩頁中parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介反應(yīng)最初,雖然產(chǎn)物就是指數(shù)增長(zhǎng),但就是熒光處于背景水平,檢測(cè)不到熒光增加。當(dāng)累積了足夠得擴(kuò)增產(chǎn)物,可以產(chǎn)生可檢測(cè)得熒光信號(hào)時(shí),這個(gè)循環(huán)數(shù)叫初始循環(huán)數(shù),即Ct。由于Ct值處于指數(shù)期內(nèi),這時(shí)得反應(yīng)成分不會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行,因此熒光定量PCR結(jié)果就是可靠得,可以準(zhǔn)確得反映反應(yīng)體系中模板得初始量。假定得例子介紹使用Delta-deltaCt法來決定一個(gè)目標(biāo)基因(p53)在腫瘤和正常卵巢組織得表達(dá)得相對(duì)水平。parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介例子:正常和腫瘤組織50ngRNA得到得cDNA用來分析p53(目標(biāo)基因)和GAPDH(參照基因)。研究表明GAPDH在正常和腫瘤組織中沒有差異。樣品Ct

p53(目標(biāo)基因)CtGAPDH(參照基因)正常(校準(zhǔn)樣本)15、016、5腫瘤(試驗(yàn)樣本)12、015、9進(jìn)行相對(duì)定量分析之前,在檢測(cè)和校準(zhǔn)得樣品中靶基因得Ct值和內(nèi)參得Ct值進(jìn)行歸一化:

△Ct(正常)=15、0-16、5=-1、5△Ct(腫瘤)=12、0-15、9=-3、9然后,試驗(yàn)樣本與校準(zhǔn)樣本得△Ct值進(jìn)行歸一化△△Ct

=△Ct(腫瘤)-△Ct(正常)=-3、9-(-1、5)=-2、4最后,計(jì)算表達(dá)比率:2-△△Ct

=2-(-2、4)=5、3因此,腫瘤組織細(xì)胞得p53表達(dá)水平比正常細(xì)胞高5、3倍。parativeDelta-deltaCt法得特點(diǎn)、注意事項(xiàng)1)、parativeDelta-deltaCt法就是常用得相對(duì)定量方法,其最大特點(diǎn)就是,當(dāng)優(yōu)化得體系已經(jīng)建立后,在每次實(shí)驗(yàn)中無需再對(duì)看家基因和目得基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線,而只需對(duì)待測(cè)樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可。2)、其缺點(diǎn)就是,每次實(shí)驗(yàn)都默認(rèn)目得基因和看家基因得擴(kuò)增效率一致,而并非真實(shí)擴(kuò)增情況得反映,這里勢(shì)必存在一定得誤差。3)、parativeDelta-deltaCt法展開定量實(shí)驗(yàn)前,在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,必需對(duì)目得基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。Rotor-Gene得軟件會(huì)自動(dòng)給出兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線得R值、擴(kuò)增效率等信息,如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線得斜率,即M值得差小于0、1,那么后續(xù)實(shí)驗(yàn)中就可以用parativeDelta-deltaCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。反之,如果M差值大于0、1,就無法用該方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。此時(shí)得解決方法有兩種,一就是優(yōu)化實(shí)驗(yàn),使兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線得斜率差值小于0、1,二就是換用其她得相對(duì)定量方法。parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介應(yīng)用實(shí)例:將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋后,分別對(duì)目得基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線軟件自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并給出相應(yīng)得參數(shù)。兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線得M值得差值<0、1parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介在完成上述預(yù)實(shí)驗(yàn)之后,接下來就可以正式對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量分析。在該實(shí)驗(yàn)中,分別對(duì)待測(cè)樣品得看家基因和目得基因進(jìn)行擴(kuò)增,下圖即為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)得擴(kuò)增分析結(jié)果:為進(jìn)行parativeDelta-deltaCt分析,需要對(duì)樣品進(jìn)行一些編輯。簡(jiǎn)而言之,即將目得基因和看家基因分別編輯在兩頁中(page),并將同一樣品命名成相同名稱。parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介在該實(shí)驗(yàn)中,分別對(duì)三個(gè)樣品A、B、C進(jìn)行了分析,其中1-9號(hào)管檢測(cè)了看家基因,10-18號(hào)管檢測(cè)了目得基因。可通過NEW新建一個(gè)page,并通過Selected選擇每頁中分析得對(duì)像。將兩組基因分別編輯在兩頁中,并將相同得樣品命名成同一名稱后,即為下圖所示:parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介Page2:目得基因,其中10-18號(hào)管通過YES選中,樣品分別命名為A、B、C,其她未選中得樣品可以不進(jìn)行編輯。Page1:看家基因,其中1-9號(hào)管通過YES選中,樣品分別命名為A、B、C,其她未選中得樣品可以不進(jìn)行編輯。parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介樣品編輯好后就可進(jìn)行分析工作。通過進(jìn)入Analysis,分別對(duì)page1和page2進(jìn)行分析。注意:由于沒有標(biāo)準(zhǔn)品,軟件無法自動(dòng)給出閾值,需用手動(dòng)設(shè)定,軟件會(huì)提示需手動(dòng)進(jìn)行閾值設(shè)定,此時(shí)只要在熒光曲線圖中上下拖動(dòng)光標(biāo)即可。parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介完成兩頁分析之后,再進(jìn)入DeltaDeltaCT分析界面,選擇show,此時(shí),軟件得向?qū)Ы缑鏁?huì)提示使用者一步完成設(shè)置:第一項(xiàng):ValidationRunPerformed,提示就是否已驗(yàn)證過兩個(gè)基因得擴(kuò)增效率一致,可用該定量方法進(jìn)行分析。選擇Yes;第二項(xiàng):GeneofInterestQuantitation,選中Page1或Page2中編輯了目得基因得那一頁;第三項(xiàng):NormaliserQuantitation,選中Page1或Page2中編輯了看家基因得那一頁;第四項(xiàng):CalibratorDefined,選中A、B、C三個(gè)樣品中用來作為對(duì)照組得一個(gè)。parativeDelta-deltaCt定量流程簡(jiǎn)介完成上述四項(xiàng)設(shè)置之后,在窗口右側(cè)就顯示相對(duì)定量結(jié)果,如圖所示:結(jié)果給出三個(gè)樣品目得基因和看家基因得平均CT值,以及樣品B、C中目得基因得濃度相對(duì)于對(duì)照組A得比值。雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程1)、用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量時(shí),每次每個(gè)基因都需要做目得基因和看家基因得標(biāo)準(zhǔn)曲線,必需有一組穩(wěn)定得標(biāo)準(zhǔn)品。2)、同一樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別對(duì)目得基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線,分列在兩頁上。雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法得特點(diǎn)、注意事項(xiàng)及實(shí)際應(yīng)用1、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法做相對(duì)定量分析得最大特點(diǎn)就是,應(yīng)用簡(jiǎn)便,無需像Delta-deltaCT法那樣對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行嚴(yán)格得優(yōu)化。2、其不足之處就是每次實(shí)驗(yàn)都必需對(duì)目得基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、并且,如果用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線得標(biāo)準(zhǔn)品不同于樣品,比如標(biāo)準(zhǔn)品為質(zhì)?；蚣兓肞CR產(chǎn)物,而待測(cè)樣品為cDNA,那么標(biāo)準(zhǔn)曲線得擴(kuò)增效率并不能真實(shí)地反映樣品得擴(kuò)增情況,因此以標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算樣品得實(shí)際濃度就存在一定誤差。雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程樣品管1-6為目得基因得標(biāo)準(zhǔn)曲線,7-12為看家基因得標(biāo)準(zhǔn)曲線;待測(cè)樣品A、B、C,

15-17擴(kuò)增了樣品得看家基因,18-20擴(kuò)增了樣品得目得基因。雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程在用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法做相對(duì)定量之前,同樣需要對(duì)樣品進(jìn)行一些編輯。方法與Delta-deltaCT法類似,即將所有目得基因編輯在一個(gè)page里,所有看家基因編輯在另一個(gè)page里,且相同得樣品以同樣名稱命名。Page1:看家基因,其中7-12號(hào)管為標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過YES選中,15-17號(hào)管為待測(cè)樣品,分別命名為A、B、C,其她未選中得樣品可不以不進(jìn)行編輯。Page2:目得基因,其中1-6號(hào)管為標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過YES選中,18-20號(hào)管為待測(cè)樣品,分別命名為A、B、C,其她未選中得樣品可不以不進(jìn)行編輯。雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程樣品編輯好后就可進(jìn)行分析工作,從Other進(jìn)入,選擇2StandardCurvesRelativeQuantitation。根據(jù)提示向?qū)б来瓮瓿稍O(shè)置。依次選中目得基因得page、看家基因得page以及對(duì)照組(例,以