第24章病毒感染的檢查方法與防治原則

第24章病毒感染的檢查方法與防治原則第一節(jié)病毒感染的檢查方法通過病毒感染的檢查，可以明確臨床標(biāo)本中是否存在某些特定的病毒，可為臨床診斷提供有力的證據(jù)，又可指導(dǎo)臨床制定正確的治療方案。同時，病毒感染的檢查結(jié)果提供了相應(yīng)疾病的發(fā)病狀態(tài)信息，能夠幫助流行病學(xué)制定有效的預(yù)防措施。病毒感染的實驗室檢查包括病毒分離與鑒定、病毒核酸與抗原的直接檢出以及特異性抗體的檢測。臨床醫(yī)師根據(jù)流行病學(xué)資料、疾病的癥狀與體征綜合判斷可能為何種病毒感染，留取適宜的標(biāo)本送檢。一、標(biāo)本的采集與送檢（一）供分離病毒、檢出核酸及抗原的標(biāo)本采集原則1．標(biāo)本采集時間在發(fā)病初期（急性期）采集標(biāo)本，較易檢出病毒，隨著標(biāo)本采集日期的推后，病毒分離的陽性率隨之降低。例如麻疹病毒分離標(biāo)本必須在出疹前三天或出疹后五天內(nèi)采集；而脊髓灰質(zhì)炎病毒分離標(biāo)本盡量在發(fā)病后14天內(nèi)采集。2．標(biāo)本類型最好在感染部位采取，如呼吸道感染采取鼻咽洗漱液、咽拭子、鼻拭子等；腸道感染采集糞便標(biāo)本；腦內(nèi)感染采取腦脊液；皮膚感染采取病灶組織，如皰疹液體；有病毒血癥時采取血液；對某些病毒尿液標(biāo)本的分離率也比較高。3．標(biāo)本運輸病毒是細胞內(nèi)寄生物，脫離活體后在室溫下很易喪失感染能力。標(biāo)本采集后，應(yīng)放入裝有冰塊的冷藏包內(nèi)盡快運送到實驗室，標(biāo)本在處理、接種前切忌反復(fù)凍融，病變組織則應(yīng)保存于50%的甘油緩沖鹽水中。4．標(biāo)本的處理與儲存采集標(biāo)本時要注意無菌操作，應(yīng)盡量避免外界污染。收到標(biāo)本后，應(yīng)盡快處理并保存標(biāo)本，處理前，含有有包膜的病毒的臨床標(biāo)本中可加入高濃度的青霉素、鏈霉素、萬古霉素等；對無包膜的病毒的臨床標(biāo)本，可在標(biāo)本內(nèi)加入一定量的氯仿。標(biāo)本中加入抗生素或氯仿的目的是殺滅標(biāo)本中可能存在的細菌、支原體、真菌等病原體。處理后的標(biāo)本要加入一定量的標(biāo)本保存液（例如，含2%胎牛血清的MEM、DMEM、PBS等），盡量及時接種，如不能當(dāng)時接種，標(biāo)本應(yīng)保存與-70℃低溫冰柜或液氮中。（二）供血清學(xué)檢測的標(biāo)本采集原則檢測特異性抗體需要采取急性期與恢復(fù)期雙份血清，第一份盡可能在發(fā)病后立即采取，第二份在發(fā)病后1個月時采集。血清標(biāo)本應(yīng)在-20℃保存，試驗前血清標(biāo)本以56℃30分鐘處理去除非特異性物質(zhì)及補體。無菌性腦炎患者也可取腦脊液檢測特異性lgM。二、病毒分離（一）細胞培養(yǎng)(cellculture)是目前最常用的分離病毒的方法。在初步了解欲分離的檢測病毒后，將選擇適當(dāng)?shù)脑囵B(yǎng)細胞或傳代細胞系等作病毒分離培養(yǎng)。接種標(biāo)本后，細胞可出現(xiàn)病變或也可并不出現(xiàn)病變而需用血細胞吸附等方法檢測是否有病毒增殖，并進一步還需用特殊的抗體鑒定病毒的種類，例如用特異熒光抗體染色或抗體中和試驗等。當(dāng)無病毒增殖時，可能標(biāo)本中病毒含量較低，未被檢出，則需要盲目傳代3次后方可明確標(biāo)本中是否存在病毒。這一分離與鑒定病毒的全過程有時可長達2～3個月，而且僅在有設(shè)備、實驗條件及合格工作人員的實驗室方可進行。雖然這種方法所需時間長、步驟多，但在確定病原上是“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，即其準(zhǔn)確性高而無誤。如欲提高病毒感染細胞培養(yǎng)的敏感性，可將病毒接種于內(nèi)有蓋玻片的細胞培養(yǎng)瓶，經(jīng)低溫離心后，以增加病毒與細胞接觸的幾率。再將蓋玻片進行培養(yǎng)，并用單克隆抗體染色，藉以通過檢測病毒的早期抗原進行診斷。1．細胞培養(yǎng)類型按細胞的來源、染色體特征及傳代次數(shù)又可分為原代細胞、二倍體細胞與傳代細胞系等3種基本類型。（1）原代細胞培養(yǎng)(primarycellculture)：用胰蛋白酶將人胚（或動物）組織分散成單細胞，加一定培養(yǎng)液，37℃孵育1～2天后逐漸在培養(yǎng)瓶底部長成單層細胞。常用的有人胚腎、猴腎、雞胚等原代細胞。原代細胞對病毒的敏感性高。原代細胞均為二倍體細胞，可用于產(chǎn)生病毒疫苗，如兔腎細胞生產(chǎn)風(fēng)疹疫苗，雞成纖維細胞產(chǎn)生麻疹疫苗，猴腎細胞生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎疫苗。因原代細胞不能持續(xù)傳代培養(yǎng)，故不便用于診斷工作。（2）二倍體細胞培養(yǎng)(diploidcellcultune)：原代細胞只能傳2～3代細胞就退化，在多數(shù)細胞退化時，少數(shù)細胞能繼續(xù)傳下來，且保持染色體數(shù)為二倍體，稱為二倍體細胞。二倍體細胞生長迅速，并可傳50代保持二倍體特征，通常是胚胎組織的成纖維細胞（如WI-38細胞系）。二倍體細胞一經(jīng)建立，應(yīng)盡早將細胞懸浮于10%二甲基亞砜中，大量分裝安瓿貯存于液氮（-196℃）內(nèi)，作為“種子”，供以后傳代用。目前多用二倍體細胞系制備病毒疫苗，也用于病毒的實驗室診斷工作。（3）傳代細胞培養(yǎng)(continouscellculture)：由癌細胞或二倍體細胞突變而來，染色體數(shù)為非整倍體，細胞生長迅速，可無限傳代，在液氮中能長期保存。常用的傳代細胞有HeLa（宮頸癌）細胞、KB（口腔癌）細胞、HEp-2（喉癌）細胞、Vero（非洲綠猴腎）細胞等。由于傳代細胞系能有規(guī)律地持續(xù)傳代，容易保存（-70℃～-196℃）且對某些病毒易感，因此，在診斷、科研等非疫苗生產(chǎn)的項目中常被采用。目前廣泛用于病毒的實驗室診斷工作，根據(jù)病毒對細胞的親嗜性，選擇敏感的細胞系使用傳代細胞系（4）淋巴細胞培養(yǎng)（lymphocyteculture）：正常成熟的淋巴細胞不經(jīng)特殊處理不能在體外傳代培養(yǎng)。然而EBV感染的B淋巴細胞卻能在體外持續(xù)傳代，這是病毒轉(zhuǎn)化細胞的例證，也是分離出EBV的標(biāo)志。T淋巴細胞在加入T細胞生長因子（IL-2）后可在體外培養(yǎng)，為研究人類逆轉(zhuǎn)錄病毒（HIV、HTLV）提供了條件，HIV在T淋巴細胞培養(yǎng)物中增殖形成多核巨細胞。2．細胞培養(yǎng)中病毒的鑒定。（1）病毒在細胞內(nèi)增殖的指征：1）細胞致病作用(cytopathogeniceffect,CPE)：病毒在細胞內(nèi)增殖引起細胞退形性變，表現(xiàn)為細胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細胞病變（圖25-2），結(jié)合臨床表現(xiàn)可作出預(yù)測性診斷。ABCD圖24-1病毒致細胞病變效應(yīng)（CPE）A.正常單層細胞（FRhK-4cell）B.SARS病毒感染的單層細胞C.麻疹病毒感染Vero-SLAM所致的融合病變D.呼吸道合胞病毒在細胞內(nèi)產(chǎn)生的包涵2）紅細胞吸附現(xiàn)象（hemadsorptionphenomenon）：流感病毒和某些副粘病毒感染細胞后24～48小時，在細胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細胞，發(fā)生紅細胞吸附現(xiàn)象。若加入相應(yīng)的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生，稱為紅細胞吸附抑制試驗。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。3）干擾現(xiàn)象(interferencephenomenon)：一種病毒感染細胞后可以干擾另一種病毒在該細胞中的增殖，這種現(xiàn)象叫干擾現(xiàn)象。前者為不產(chǎn)生CPE的病毒（如風(fēng)疹病毒）但能干擾以后進入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者進入宿主細胞不再生產(chǎn)CPE。（2）病毒感染性的定量測定：1）空斑形成單位(plaque-formingunit,PFU)：測定這是一種測定病毒感染性比較準(zhǔn)確的方法。將適當(dāng)濃度的病毒懸液接種到生長單層細胞的玻璃平皿或扁瓶中，當(dāng)病毒吸附于細胞上后，再在其上復(fù)蓋一層溶化的半固體營養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。當(dāng)病毒在細胞內(nèi)復(fù)制增殖后，每一個感染性病毒顆粒在單層細胞中產(chǎn)生一個局限性的感染細胞病灶，病灶逐漸擴大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中顯出沒有著色的“空斑”，清楚可見。由于每個空斑由單個病毒顆粒復(fù)制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位（PFU）來表示。2）50%致死量（LD50）或50%組織細胞感染量（TCID50）的測定：本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚、易感動物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚、易感動物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時間后，觀察細胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方法計算出50%感染量或50%組織細胞感染量，可獲得比較準(zhǔn)確的病毒感染性滴度。3）病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察：病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬哪一科。（3）病毒的病原學(xué)鑒定：病毒在細胞中生長、使細胞出現(xiàn)病變后還可用免疫熒光等方法直接檢測病毒抗原、分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、序列同源性比較等加以鑒定（見病毒的核酸檢測）。（二）動物接種(animalinoculation)是最原始的病毒分離方法，目前已很少應(yīng)用。常用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和猴等動物，接種途徑根據(jù)各病毒對組織的親嗜性而定，有鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腦內(nèi)、腹腔及靜脈等。例如嗜神經(jīng)病毒（腦炎病毒）接種鼠腦內(nèi)；柯薩奇病毒可接種于乳鼠腹腔內(nèi)。接種后逐日觀察實驗動物發(fā)病情況，如有死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續(xù)傳代，并作鑒定。但要注意有些動物對人類病毒不敏感，或感染后癥狀不明顯。此外，也應(yīng)防止將動物體內(nèi)的潛在病毒當(dāng)作真正的病原體。（三）雞胚接種（Chickembryoinoculation）雞胚是正在發(fā)育中的機體，有些人及動物病毒能在雞胚中增殖，因此雞胚培養(yǎng)是分離某些病毒的一種有效方法。如有病毒增殖，則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、尿囊液出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象。按病毒種類不同，可使用不同胚齡的雞胚，接種于不同部位(見圖24-2)。常用的接種部位有：絨毛尿囊膜：用于培養(yǎng)天花病毒、痘苗病毒及HSV等；尿囊腔：用于流感病毒及腮腺炎病毒的培養(yǎng)；羊膜腔：用于流感病毒的初次分離培養(yǎng)；卵黃囊：用于某些嗜神經(jīng)病毒的培養(yǎng)。需要注意的是很多病毒在雞胚中不生長。圖24-2雞胚接種示意圖三、病毒抗原的直接檢出除對細胞培養(yǎng)中病毒可進行鑒定外，對一些血清型別不多或在常規(guī)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中還不能成功培養(yǎng)的病毒，應(yīng)用免疫熒光或酶聯(lián)免疫吸附實驗直接檢測病毒抗原是快速而簡單的方法。（一）免疫熒光法（immunofluorescentassay）根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)特點，將熒光色素與待檢病毒的特異性抗體以化學(xué)的方法結(jié)合起來。而后將熒光標(biāo)記了的抗體在特定的條件下浸染標(biāo)本，使抗體與標(biāo)本中的抗原（病毒）發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，細胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標(biāo)記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光，根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。免疫熒光（IF）法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點。此方法主要包括直接免疫熒光法、間接免疫熒光法以及在間接法的基礎(chǔ)上發(fā)展而成的補體結(jié)合法。（二）酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA）使用病毒特異性抗體檢測標(biāo)本中的病毒抗原。ELISA法用于鑒定病毒具有簡便、快速、特異的優(yōu)點。四、病毒抗體的直接檢出應(yīng)用病毒特異性抗原檢測病毒感染患者血清中的抗體也是診斷病毒感染的重要手段，可有IgG和IgM兩種。IgM抗體出現(xiàn)于病毒感染早期，可用于快速診斷病毒感染。IgG抗體出現(xiàn)較遲，在血清中存在的時間也較長，因此IgG類抗體用于臨床診斷必須具有早期和恢復(fù)期雙份血清，或有隨訪的血清，兩次標(biāo)本中抗體的效價需有4倍或以上的升高才有診斷價值。ELISA或免疫印跡法可檢測血清中針對某種病毒抗原亞單位的抗體，例如，該法已用于HIV患者抗體的確認實驗。其他常用的方法還包括：(一)中和試驗(neutralizationassays)是病毒在活體內(nèi)或細胞培養(yǎng)中被特異性中和抗體作用而失去感染性的一種試驗，可用來檢查患者血清中抗體的消長情況，也可用來鑒定未知病毒或研究病毒的抗原結(jié)構(gòu)。中和抗體特異性高，維持時間長，因此流行病學(xué)檢查常用此法。(二)補體結(jié)合試驗(complementFixationAssays)常用病毒內(nèi)部可溶性抗原檢測血清中IgM類抗體，因同種異型間常有交叉反應(yīng)發(fā)生，故本試驗特異性較中和試驗低。但因體內(nèi)補體結(jié)合抗體產(chǎn)生早、消失快，常用于病毒早期感染的診斷。(三)血凝抑制試驗(hemagglutinationInhibitionAssays)許多病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，稱血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被相應(yīng)的抗血凝素抗體所抑制，稱血凝抑制。檢測血凝抑制抗體的試驗為血凝抑制試驗。本試驗簡便、快速，且特異性高，常用于流感病毒及乙型腦炎病毒等有血凝素病毒感染的診斷及流行病學(xué)調(diào)查，也可用于鑒定病毒的型及亞型。五、檢測病毒核酸由于大多數(shù)病毒的基因均已克隆并已知道其核苷酸序列，因此可以利用病毒的基因作為探針(probes)進行雜交以檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)的病毒核酸，或針對病毒的序列設(shè)計相應(yīng)的引物，作多聚酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReactionAssays,PCR）。近年隨著技術(shù)的進步，已研制出多種高通量的檢測病毒核酸的技術(shù)。(一)核酸雜交技術(shù)(nucleioacidhybridizationtechnique)核酸雜交是病毒診斷領(lǐng)域中發(fā)展較快的一項新技術(shù)，主要分為Southern雜交和Northern雜交兩大類。其基本原理是雙鏈DNA（或RNA）在加熱或堿處理下，變性解開成單鏈，然后用一條已知的特異性的核苷酸序列的單鏈DNA，以同位素或非放射性核素標(biāo)記后制成探針去與固態(tài)支持物上的變性單鏈DNA進行雜交，再用放射自顯影技術(shù)或用生物素-親和素系統(tǒng)進行檢查，以確定待測核酸中有無與探針DNA同源的DNA存在。由于病毒基因很多已成功地被克隆及進行了核苷酸序列測定，因此可以利用特定的病毒基因作為探針，用核酸雜交的方法檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)的病毒核酸。核酸雜交技術(shù)方法包括有斑點核酸雜交、細胞內(nèi)原位雜交、DNA印跡雜交和RNA印跡雜交等。(二)PCR技術(shù)近年來發(fā)展了一系列以PCR為基礎(chǔ)的體外核酸擴增技術(shù)，用于檢測不易感或不能培養(yǎng)的病毒。PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，主要由高溫變性(denaturation)、低溫退火(annealling)和適溫延伸(extension)三個步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成。即在高溫(93～95℃)下，待擴增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫(37～60℃)情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度下(72℃)，以引物3′端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5′～3′方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)段拷貝數(shù)擴增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的指數(shù)迅速擴大。經(jīng)過25至30個循環(huán)后，將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外燈照射下（254nm）可見到DNA的特異擴增區(qū)帶。此方法特異性強、敏感性高、簡便快速，已成功用于HCV、HIV、CMV、HPV等多種病毒性感染的臨床檢測中。由于PCR方法十分敏感，可檢出fg水平的病毒核酸，故操作時應(yīng)注意PCR產(chǎn)物的氣溶膠污染以防出現(xiàn)假陽性。此外，病毒核酸檢測陽性并不等于標(biāo)本中存在有感染性的活病毒。隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，派生出了一系列的新技術(shù)和方法，根據(jù)不同的檢測目的可以選用相適應(yīng)的技術(shù)方法。如利用實時定量PCR法(realtimequantitaticePCR)檢測病毒載量(viralload)；利用原位(insitu)PCR法定位檢測細胞或組織中的病毒感染；利用巢式(nested)PCR可以提高PCR的第三性和特性等等。其中，熒光實時定量PCR技術(shù)發(fā)展迅速，TaqMan水解探針法、雜交探針法和分子信標(biāo)法等技術(shù)被應(yīng)用于熒光實時定量PCR檢測，并得到了廣泛的臨床應(yīng)用。此種技術(shù)除了能準(zhǔn)確定量病人體液中病毒載量外，還可用于檢測病毒的耐藥突變，因此主要被用于臨床療效的考核和病毒耐藥的監(jiān)測。(三)高通量的病毒核酸檢測技術(shù)近年隨著對突發(fā)傳染病病原體的快速鑒定的需求，國內(nèi)外已研制出基于不同技術(shù)原理的高通量病毒核酸檢測技術(shù)，如DNA芯片技術(shù),以便快速準(zhǔn)確地篩查出導(dǎo)致傳染病爆發(fā)流行的病原體。DNA芯片技術(shù)隨著人類基因組計劃應(yīng)運而生，其原理是將已知的成千上萬特異的基因探針，高密度有序排布于小塊硅片等載體上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列(microarray)，然后與標(biāo)記的待測樣品進行雜交。芯片上的信號通過共聚焦顯微鏡(confocalmicroscope)或者激光掃描儀(laserscanner)進行掃描檢測，由計算機記錄雜交結(jié)果，然后對雜交位點及其信號強弱進行分析，并與探針陣列的位點進行比較，就可以得到待測樣品的遺傳信息，從而判斷標(biāo)本中的特異性病原體的存在。目前基因芯片主要有兩種，一種是DNA合成芯片，在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸；另一種是DNA微集芯片，將克隆基因或PCR擴增的基因片段有序地顯微打印到芯片上。DNA芯片技術(shù)的優(yōu)點是一次性可以完成大量樣品DNA序列的檢測和分析，最新研發(fā)的高密度病原體基因芯片能檢測1700多種人類病毒。DNA芯片技術(shù)解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)的許多不足，在病毒診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面有著廣闊的應(yīng)用前景。六、病毒感染的快速診斷對病毒性感染作出明確診斷在指導(dǎo)臨床用藥、選用治療手段和判斷疾病的預(yù)后方面十分重要，對預(yù)防和控制某些傳染?。ㄈ缌餍行愿忻?、病毒性腦炎）的流行也有一定意義。病毒分離和血清學(xué)試驗方法往往需要長時間才能得出結(jié)果，而病毒性感染的快速診斷則彌補了上述缺點，更具實用價值。除用光學(xué)顯微鏡和電鏡觀察包涵體及病毒顆粒，用免疫學(xué)方法檢測病毒抗原、抗體外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前病毒核酸的檢測也已得到廣泛應(yīng)用。(一)形態(tài)學(xué)檢查法1．光學(xué)顯微鏡檢查法(Opticalmicroscopy)光學(xué)顯微鏡是病毒診斷的輔助方法之一，借助染色技術(shù)可以直接觀察病毒產(chǎn)生的核內(nèi)或胞漿內(nèi)包涵體和病毒感染細胞的具體形態(tài)。某些受病毒感染的細胞內(nèi)，可形成與正常細胞結(jié)構(gòu)和著色不同的斑塊，稱為包涵體。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查包涵體，根據(jù)不同病毒包涵體的形態(tài)、染色、存在部位的差異，可輔助診斷某些病毒性疾病。例如從病犬大腦海馬會發(fā)現(xiàn)胞漿中嗜酸性包涵體（內(nèi)基小體），即可確診為狂犬病；在麻疹病毒感染細胞的核內(nèi)及胞漿內(nèi)可找到一個或多個鮮紅色的圓形、橢圓形或不規(guī)則形態(tài)的包涵體，被稱為麻疹病毒包涵體。2．電鏡(electronmicroscopy,EM)和免疫電鏡檢查電子顯微鏡技術(shù)可直接觀察病毒的大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及病毒在細胞內(nèi)增殖的動態(tài)過程。制作電鏡標(biāo)本的方法主要有超薄切片（厚度為100nm左右），磷鎢酸負染法等。超薄切片法也稱正染法，將細胞固定、脫水、包埋、切片、染色，然后觀察病毒顆粒，可顯示病毒形態(tài)及形態(tài)發(fā)生過程。負染色法敏感性低，通過濃集病毒的辦法使樣品含有高濃度病毒顆粒（106～107/ml），經(jīng)磷鎢酸負染后直接用于電鏡檢查，可顯示病毒的結(jié)構(gòu)。這種方法可有助于診斷難以在細胞培養(yǎng)中增殖的病毒，例如從病人糞便標(biāo)本中觀察是否有輪狀病毒的感染。3．免疫電鏡技術(shù)(immuneelectronmicroscopy,IEM)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對抗原物質(zhì)進行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、膠體金等標(biāo)記后，使之與抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。在難以分辨病毒顆粒與其外周伴隨的結(jié)構(gòu)的情況下，若將病毒樣品制成懸液，加入特異性抗體，可使樣品中的病毒顆粒凝集成團，再用電鏡觀察可提高病毒的檢出率。利用這種方法從痘病毒、皰疹病毒感染的皰疹液中，以及疑為輪狀病毒感染的糞便或HBV感染者血清中均可快速檢出典型的病毒顆粒，能幫助早期診斷。（二）免疫學(xué)檢查法1．檢查病毒抗原:病毒抗原的檢測是診斷病毒感染的依據(jù)之一，在不必分離培養(yǎng)病毒的情況下，直接用特異性標(biāo)記抗體檢查標(biāo)本中是否有相應(yīng)病毒抗原存在。由于其基本原理是抗原抗體反應(yīng)，因此要求標(biāo)本中有一定量的病毒抗原存在。常用的方法有免疫熒光法，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）或乳膠凝集法等。這些方法相對于病毒分離培養(yǎng)方法和形態(tài)學(xué)檢測方法，具有快速、敏感、準(zhǔn)確、操作簡便等優(yōu)點，因此十分適宜在臨床病毒檢測中應(yīng)用。2．檢查病毒特異性IgM:病人體液中病毒抗體的檢測也是快速診斷病毒感染的常用方法之一。檢測抗體用的病毒抗原可以是基因工程表達的重組抗原，也可以是根據(jù)編碼基因片段推導(dǎo)的合成肽作為抗原。目前該方法已用于風(fēng)疹病毒、乙型腦炎病毒、流行性出血熱病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等感染的早期診斷。3．多種病毒抗原抗體檢測方法:在新發(fā)突發(fā)傳染病原體的診斷中需要快速的病原體篩查技術(shù)以便盡快地確認爆發(fā)流行的為何種病毒，傳統(tǒng)的抗原抗體檢測方法僅能在一次實驗中檢測一種病原體，不能在短時間內(nèi)篩查到致病原，因此研制出的高通量的病毒抗原抗體檢測技術(shù)，可以在一次實驗中完成十幾甚至幾十個病毒的檢測。例如蛋白液相芯片技術(shù)，把針對不同病毒的抗原或抗體以共價方式結(jié)合到特定顏色的微球上，一種顏色對應(yīng)一種病毒。應(yīng)用時，先把幾十種不同顏色的微球混合，再加入病人體液標(biāo)本中（被測物為血清中病毒抗原或抗體）孵育，并加上熒光標(biāo)記，然后微球成單列通過激光掃描，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理后可以直接用來判斷結(jié)果。此種方法已經(jīng)初步應(yīng)用于呼吸道病毒的高通量篩查中，實踐證明其檢測敏感度和檢測速度均優(yōu)于ELISA方法。（三）病毒核酸檢測技術(shù)鑒于多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）具有快速敏感的優(yōu)點，已在快速診斷病毒感染中發(fā)揮了重要作用，如近年對禽和人流感病毒感染的檢測等。但它們也存在不少缺點，由于敏感性較高，操作不當(dāng)易造成污染；病毒核酸陽性不等于標(biāo)本中存在有感染性的活病毒。此外對未知病毒及可能出現(xiàn)的新病毒則不能采用這些方法。對于未知病毒及可能出現(xiàn)的新病毒，近年采用代表性差異分析、基于保守序列的多聚酶鏈反應(yīng)、cDNA文庫的篩選等方法已發(fā)現(xiàn)多個新病毒，如HCV，HGV，新型漢坦病毒等。利用上述已有的傳統(tǒng)病毒分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)檢查、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法快速診斷或排除病毒感染外，也可成功地鑒定出未知新病毒，SARS冠狀病毒(coronavirus)的發(fā)現(xiàn)就是一個典型的例子。研究人員把SARS病人的咽拭子標(biāo)本與Vero6細胞共孵育，通過病毒培養(yǎng)可在光鏡下觀察到明顯的細胞病變效應(yīng)，進一步電鏡觀察發(fā)現(xiàn)增殖的病毒具有冠狀病毒的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，同時免疫組化和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)這種病毒與冠狀病毒組I的抗血清有交叉反應(yīng)，提示這種病毒與冠狀病毒有親緣關(guān)系，可能為冠狀病毒家族成員之一。繼續(xù)利用冠狀病毒保守序列引物擴增病毒基因片段，得到一長約405bp的PCR產(chǎn)物，測序后確認為是一種不同于已知冠狀病毒的冠狀病毒家族新成員，被命名為SARS冠狀病毒。第二節(jié)病毒感染的免疫預(yù)防免疫預(yù)防(immuneprevention)，是通過人工接種生物制劑的方法從而達到預(yù)防疾病、控制和消滅人類傳染病的目的?！叭斯っ庖摺?，即免疫預(yù)防所采取的方法統(tǒng)稱。二十世紀(jì)人類通過實施全面進行人工免疫，使得許多傳染性疾病得到很好的控制，乃至消滅。用牛痘苗預(yù)防天花是免疫預(yù)防成功的最早實例，1979年10月26日，世界衛(wèi)生組織宣布世界上已經(jīng)完全消滅了天花。與之相對，人類用于控制病毒感染的治療藥物還十分有限，其效果遠不如抗生素等對細菌感染的療效，因此對病毒感染的免疫預(yù)防顯得尤為重要。一、人工主動免疫應(yīng)用抗原性物質(zhì)的人工免疫稱為人工主動免疫。預(yù)防病毒感染的人工主動免疫生物制品主要有以下幾類。(一)減毒活疫苗(liveattenuatedvaccines)減毒活疫苗是通過選用毒力下降的病毒突變株作疫苗株。由于疫苗為活病毒株，該種病毒具有病毒的性質(zhì)，可以在原位繁殖。所以減毒活疫苗的優(yōu)點是可以自然感染方式接種；疫苗株可在體內(nèi)增殖，通過類似自然感染的方式，從體液免疫和細胞免疫兩個層面刺激機體產(chǎn)生所獲得的免疫力；能保持長時間的免疫力；接種量與接種次數(shù)均較滅活疫苗少。但減毒活疫苗保存與運輸均應(yīng)冷藏，室溫下易滅活；減毒活疫苗存在遺傳危險性，在人群中有毒力回復(fù)突變的可能。因而對有免疫缺陷，尤其是細胞免疫功能低下者或使用免疫抑制劑患者應(yīng)選用滅活疫苗或提純的蛋白疫苗。常用的減毒活疫苗有Sabin脊髓灰質(zhì)炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、麻疹疫苗、水痘疫苗、腮腺炎疫苗、乙型腦炎疫苗、甲型肝炎疫苗等。(二)滅活疫苗(inactivatedvaccines)滅活疫苗是通過理化方法將有毒力的病毒滅活后制成的疫苗。由于病毒株經(jīng)過滅活過程，該種疫苗失去感染性但仍保持原病毒的抗原性。因此滅活疫苗的優(yōu)點是穩(wěn)定，使用安全，但需要注射較大劑量才能誘發(fā)出有效的免疫力，且不能誘導(dǎo)產(chǎn)生粘膜免疫和細胞免疫。在免疫過程常需多次疫苗注射，一定時間內(nèi)還需加強注射。因此滅活疫苗的使用不如活疫苗經(jīng)濟方便，且免疫力維持時間也較活疫苗短。常用的滅活疫苗有Salk脊髓灰質(zhì)炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性乙型腦炎疫苗和流感疫苗等。(三)基因工程疫苗(recombinantproteinvaccines)基因工程疫苗是通過應(yīng)用重組DNA技術(shù)，運用載體將編碼病毒特異性保護抗原的基因片段插入酵母或大腸埃希菌的基因組中，從而表達病毒的特異性抗原。通過注射純化后的病毒抗原，從而引發(fā)機體的免疫反應(yīng)。由于基因工程疫苗表達的是病毒蛋白，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可以分為亞單位疫苗和多肽疫苗。由于只使用病毒的亞單位或肽段作為疫苗，所以可以避免活病毒感染，在生產(chǎn)疫苗的過程中也不需要活病毒的復(fù)制。但是由于酵母及大腸埃希菌的蛋白修飾有異于人類，導(dǎo)致其免疫原性較差。常見的乙肝疫苗即是通過在酵母中真核表達HBsAg所獲得。此外通過基因工程技術(shù)，傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)開發(fā)的技術(shù)得到提高。如傳統(tǒng)的疫苗減毒過程常常需要通過長期傳代篩選獲得減毒株，因此開發(fā)新疫苗的時間長成本大。通過反向基因技術(shù)，可以對病毒毒力基因直接修改，再運用基因重組技術(shù)獲得重組減毒株。該方法已運用于如流感病毒在內(nèi)的一些呼吸道病毒的疫苗開發(fā)之中。(四)核酸疫苗(nucleicacidvaccine)核酸疫苗是通過在真核細胞中表達的載體（如質(zhì)粒DNA）編碼病原體有效免疫原基因重組而成。廣義的核酸疫苗還包括模擬病毒表位的合成肽疫苗、抗獨特型疫苗、表達多種病毒表位的聯(lián)合多價疫苗等。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗兩類，因?qū)嶒灱夹g(shù)問題研究最多的是DNA疫苗。核酸疫苗接種后，會在所進入細胞內(nèi)表達重組DNA疫苗核酸所編碼的病毒的抗原蛋白，從而刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫?；蛞呙缇哂幸恍┟黠@的優(yōu)點：基因疫苗具有共同的理化特性，因此可以將含有不同抗原基因的質(zhì)?；旌线M行聯(lián)合免疫；質(zhì)粒載體沒有免疫原性，因此可以反復(fù)使用；基因疫苗在接種后，所編碼的蛋白抗原在宿主細胞內(nèi)表達，加工處理及抗原提呈過程與病原體的自然感染相似，因而可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞和體液免疫；因外源基因在體內(nèi)存在較長時間，不斷表達外源蛋白，持續(xù)給免疫系統(tǒng)以刺激，因此能夠使機體產(chǎn)生較強和較持久的免疫應(yīng)答。但核酸疫苗在小動物中與大動物中誘生免疫應(yīng)答效果不完全一致。此外若用于人體，注射的核酸量極大，且存在潛在安全問題，如不應(yīng)引起自身免疫應(yīng)答，不發(fā)應(yīng)生病毒核酸基因整合等。核酸疫苗現(xiàn)在還處于研究階段，有些病毒的核酸疫苗，在人體已作為預(yù)防性疫苗進行了臨床研究；在動物模型中已證實核酸疫苗具有一定的治療效果?，F(xiàn)在投入臨床實驗的核酸疫苗主要集中在傳統(tǒng)疫苗手段無法獲得有效疫苗的病毒，如HIV、HCV等。二、人工被動免疫人工被動免疫(artificialpassiveimmunization)是指注射含有抗病毒中和抗體的免疫血清、丙種球蛋白和IL-2，以及與細胞免疫有關(guān)的轉(zhuǎn)移因子、干擾素等，使機體立即獲得特異性免疫力。由于這些免疫物質(zhì)不是機體自己產(chǎn)生的，而是被動得到的，故稱為“被動免疫”。人工被動免疫的生物制劑注入機體后可立即生效，可用于某些急性傳染病的應(yīng)急性預(yù)防和治療，但因這些免疫物質(zhì)不是病人自己產(chǎn)生，故免疫力維持時間短，約3周左右。如果宿主已受到感染，采用人工主動免疫便為時過晚，此時應(yīng)該進行人工被動免疫。(一)普通免疫球蛋白("Normal"immuneglobulin)普通免疫球蛋白主要是來源于健康人靜脈血來源和胎盤血的免疫球蛋白的復(fù)合物。由于含有健康人群在生長發(fā)育過程中曾有過許多隱性感染，故血清具有相應(yīng)的多樣抗體，因而有增強機體抵抗力以預(yù)防感染的作用。其血清（或胎盤）中可含有多種病原體的抗體。因為該類制劑不是針對某一特定病原體的特異抗體，所以它們的免疫效果不如專門的特異免疫球蛋白抗體制品也不能預(yù)防一些特殊的疾病感染如HIV、SARS等。丙種球蛋白主要用于免疫缺陷病以及傳染性肝炎、麻疹、水痘、腮腺炎、帶狀皰疹等病毒感染。(二)抗病毒血清抗病毒血清是直接將微生物接種實驗動物，當(dāng)動物獲得免疫力后，把含有抗體的血清精制后制成的產(chǎn)品。由于抗病毒血清來自于異種動物，可能會引起強烈的全身生理反應(yīng)如Ⅰ型超敏反應(yīng)。在乙型肝炎病毒感染中，高效價的含抗乙肝病毒的人特異性免疫球蛋白（HBIg）具有被動保護作用，在預(yù)防乙型肝炎的母嬰傳播中可與疫苗聯(lián)合使用，有顯著效果。常用的抗病毒血清有抗狂犬病的血清和抗乙型腦炎的血清等。(三)免疫調(diào)節(jié)劑免疫調(diào)節(jié)劑主要指一大類能夠增強、促進和調(diào)節(jié)免疫功能的生物制品。免疫調(diào)節(jié)劑對于免疫功能健全的生物體作用并不大，但是對于艾滋病患者和某些處于免疫功能較弱的個體卻有較好的治療效果。不過此類制劑本身具有生理活性，應(yīng)用時常伴有相對應(yīng)的頭痛發(fā)熱等不良反應(yīng)，其反應(yīng)程度也因人而異。常用的免疫調(diào)節(jié)劑包括轉(zhuǎn)移因子、白細胞介素、胸腺素、干擾素等(詳見抗病毒治療二)。第三節(jié)抗病毒治療(antiviraltherapy)雖然人類通過使用疫苗有效的控制了包括天花、乙型肝炎在內(nèi)的多種病毒的蔓延，但是諸如丙型肝炎、西尼羅河病毒等尚無有效的疫苗預(yù)防，所以仍需要抗病毒藥物來抗擊病毒的復(fù)制。常見抗病毒治療分為抑制病毒和提高機體免疫兩個方面，既一方面選用抑制病毒復(fù)制的化學(xué)藥物或制劑，另一方面提高機體的免疫應(yīng)答，促進自身消滅病毒感染的細胞效能。雖然人類在抗生素的研發(fā)方面卓有成效，但在抗病毒治療的研究是一個新的研究領(lǐng)域，迄今理想的抗病毒藥物并不多。抗病毒藥物研發(fā)較抗菌藥物的研發(fā)主要有如下難點：一是多數(shù)病毒如麻疹等都為急性轉(zhuǎn)歸，發(fā)現(xiàn)疾病是已經(jīng)被機體清除無需使用藥物；二是由于病毒的生命周期依賴與宿主的生理功能，所以干擾病毒復(fù)制增殖的化合物常常對機體也有副作用；三是病毒較細菌有更為專一種屬特異性，如乙型肝炎、麻疹病毒等都沒有理想的動物模型。以上種種限制從而影響了抗病毒藥物的研發(fā)工作的開展。一、化學(xué)治療(chemotherapy)病毒的復(fù)制循環(huán)是由病毒的粘附侵入及脫衣殼、病毒mRNA合成翻譯及修飾、病毒基因組的復(fù)制以及病毒的包裝釋放等步驟。從理論上抑制病毒復(fù)制的藥物可以針對上述提到的每一個步驟，所以抑制病毒復(fù)制的目的化學(xué)治療可以以此分類。(一)抑制病毒穿入、脫殼及病毒釋放病毒的吸附和包裝釋放是病毒感染的最初和最終環(huán)節(jié)，抑制這些環(huán)節(jié)能阻止病毒在體內(nèi)的進一步傳播。早在20世紀(jì)60年代，就發(fā)現(xiàn)金剛烷胺能在體內(nèi)外對甲型流感病毒具有抑制作用。其機制主要是影響病毒的吸附，并影響其與宿主細胞膜的融合及脫衣殼。在臨床應(yīng)用中，數(shù)據(jù)提示其能對流感起到一定的預(yù)防作用。但是由于金剛烷胺副作用較大，未被臨床廣泛采用。近年來對病毒（尤其是HIV）的新藥研發(fā)也有不少的藥物針對這個步驟。最近報道有針對起吸附作用的包膜蛋白gp120中結(jié)合CD4的保守序列，設(shè)計的抑制兩者結(jié)合的小分子藥物能達到阻止病毒感染的作用。在預(yù)防禽流感中應(yīng)用的達菲也是針對流感病毒神經(jīng)氨酸酶設(shè)計的，該藥可以有效地抑制神經(jīng)氨酸酶介導(dǎo)的細胞間擴散。達菲作為預(yù)防使用，可達到90%以上的效果。(二)抑制病毒核酸復(fù)制及mRNA合成1．核苷類類似物(nucleosideAnalogs)核苷類類似物是臨床應(yīng)用最廣泛的抗病毒藥物之一。該類藥物是針對病毒的聚合酶所設(shè)計特異性藥物干擾病毒的核酸的合成，從而影響病毒的基因組復(fù)制。因核苷類類似物是以前藥形式存在，所以其發(fā)揮作用時需要被磷酸化。各核苷酸類似物因其針對聚合酶的特異性的毒性差別較大，如無環(huán)鳥苷幾乎沒有毒性，而疊氮胸苷毒性非常高。此外，核苷類化合物血漿半衰期很短，只有1～4個小時。目前常用的有：①阿昔洛韋（無環(huán)鳥苷，acyclovir,ACV），因其能選擇性地作用于皰疹病毒而較少產(chǎn)生副作用，對抗皰疹病毒有著強大的效用。其作用機制是無環(huán)鳥苷作為前藥，該藥物需要通過三磷酸激酶轉(zhuǎn)化，成為具有抗病毒活性的三磷酸無環(huán)鳥苷。在非感染的細胞中會在將無環(huán)鳥苷轉(zhuǎn)化為一磷酸無環(huán)鳥苷，ACV只能在感染細胞中發(fā)揮作用，所以阿昔洛韋治療更具有特異性。經(jīng)測定，無環(huán)鳥苷抑制單純皰疹病毒Ⅰ型的復(fù)制與抑制宿主細胞生長的濃度相差約3000倍，不僅提高了療效還降低了副作用。除局部使用外，也可用于注射，因此可減少皰疹病毒腦炎的死亡率并延長病人生命。②疊氮脫氧胸苷（azidothymidine,AZT），最早用于抗腫瘤的治療，在1987年被批準(zhǔn)第一個用于HIV治療的藥物。AZT對病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制比對細胞DNA聚合酶的抑制強100倍，故HIV感染者使用后，能有效降低艾滋病的發(fā)病與病死率。但在治療6個月后，已發(fā)現(xiàn)有耐藥毒株的出現(xiàn)。此外該藥會導(dǎo)致細胞間三磷酸胸腺嘧啶的耗竭，故而選擇性較ACV低，存在嚴(yán)重的副作用；③拉米呋定（lamivudine,雙脫氧硫代胞嘧啶核苷，簡稱3TC）該藥早期主要用于艾滋病的治療，而近年來在臨床應(yīng)用于乙型肝炎的治療。臨床發(fā)現(xiàn)該藥可迅速抑制慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBV的復(fù)制，使血清HBVDNA轉(zhuǎn)陰，促進HBeAg血清轉(zhuǎn)換，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineamino-transferase,ALT）正常。但是該藥物停止使用后會存在病毒載量的反彈。長期使用藥物，會發(fā)現(xiàn)病毒耐藥株的存在導(dǎo)致治療失敗。④病毒唑（3-氮唑核苷，ribavarin），也是需在細胞酶作用下磷酸化的藥物?？墒辜毎筒《緩?fù)制所必須的鳥嘌呤核苷減少，故可抑制多種RNA和DNA病毒復(fù)制。主要用于RNA病毒感染的治療，如呼吸道合胞病毒感染引起的毛細支氣管炎，流行性出血熱等。但因其對細胞核酸也有抑制作用，故副作用較多。⑤皰疹凈（5-碘2-脫氧尿嘧啶核苷，idoxuridine,IDU），常用于眼皰疹病毒感染的治療；⑥阿糖腺苷（adeninearabinaside,Ara-a），可用于治療皰疹性角膜炎及皰疹病毒腦炎。2．非核苷類似物是一類非競爭性抑制劑，較之核苷類似物其特征是不需要經(jīng)過磷酸化，針對逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程。以HIV為例，其機制是通過與HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶的活性中心或附近部位結(jié)合，從而抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。該類藥物能夠高度專一地抑制HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶，對HIV-2及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制作用很低或無作用。非核苷類似物與核苷類似物聯(lián)用對HIV-1復(fù)制的抑制有協(xié)同作用。這類藥物主要有nevirapine（奈韋拉平）delaviradine（德拉韋拉定）及pyridone（吡啶酮）等。(三)抑制病毒蛋白的修飾許多病毒需要通過其自身編碼的特異性蛋白酶將翻譯后生成的多聚蛋白質(zhì)切割成具有功能活性的肽段。如HIV的pol基因編碼的蛋白酶在產(chǎn)生成熟顆粒的過程所必需的，它通過自身切割從Gag-Pol前體多聚蛋白上脫離，在剩余部分分割成不同肽段，形成獨立的六個蛋白（MA、CA、p2、NC、p1和p6）和三個酶（蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶）。因此，有一類藥物針對蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，從原子水平研究其構(gòu)象設(shè)計并研制出病毒蛋白酶所對應(yīng)的特異性抑制劑,稱為病毒蛋白酶抑制物(proteaseInhibitors)。應(yīng)用該類抑制劑可以使病毒前體多聚蛋白不被酶解，使得感染細胞只能產(chǎn)生非感染性病毒顆粒，從而阻止病毒在細胞間傳播?，F(xiàn)已在HIV中設(shè)計出針對蛋白酶活性位點的抑制劑，并應(yīng)用于臨床，可以有效降低病毒載量，增加CD4+細胞計數(shù)，主要用于HIV晚期感染者。單藥療效不佳，常與核苷類藥物聯(lián)用。華裔美國科學(xué)家用核苷類和（或）非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑加蛋白酶抑制劑組合成二聯(lián)或三聯(lián)療法治療HIV感染，被稱為“雞尾酒”治療方案，可較長期抑制病毒復(fù)制，推遲HIV病情發(fā)展，延長病人壽命。其商品名稱分別為saquinavir（薩喹那韋）、indinavir（英迪那韋）、及ritonavir（瑞托那韋）等。二、免疫治療病毒的化學(xué)治療并不直接引起病毒性疾病的痊愈以及病毒的清除。無論何種化學(xué)藥物都只能抑制病毒，并不能徹底清除病毒，而是依靠機體免疫在化學(xué)藥物治療抑制病毒復(fù)制后將殘余的病毒清除。由此可見，病毒性疾病的免疫治療同樣也是抗病毒治療的重要手段。目前免疫療法可分為非特異免疫治療性及特異性免疫治療，后者又可分為被動特異性免疫治療及主動特異性免疫治療兩種。非特異性免疫治療主要通過增強機體的非特異性細胞和體液免疫，可包括采用胸腺素（thymosin）、IL-12、IL-2、豬苓多糖、聚肌胞、levamisole及自身LAK細胞回輸療法等。被動特異性免疫治療，主要包括免疫核糖核酸（iRNA）、病原特異性轉(zhuǎn)移因子和特異性T細胞療法等。主動特異性免疫治療主要指將病原的抗原成分或相應(yīng)結(jié)構(gòu)（疫苗）接種機體，以激發(fā)、增強和調(diào)控機體抗病原的特異性免疫應(yīng)答，達到治療的目的。因其接種對象為已發(fā)生持續(xù)感染的患者，可發(fā)揮治療作用，故稱為治療性疫苗，通過單獨或抗病毒藥物聯(lián)合使用，有可能最終達到清除機體內(nèi)病原微生物感染的目的。以下分別介紹免疫調(diào)節(jié)或治療劑、免疫細胞的修飾與回輸、免疫基因治療三種類型。(一)免疫調(diào)節(jié)或治療劑包括細胞因子、Toll樣受體配體、抗體、抗原肽以及其它免疫治療劑等，其中使用最廣的是細胞因子療法。用于抗病毒的細胞因子主要IFN、TNF、IL-2、IL-8、IL-10、IL-12等。各類細胞因子可以單獨使用也可以聯(lián)合使用。由于細胞因子自身具有生理活性，也會產(chǎn)生相對應(yīng)的副作用，其程度因個體差異而不同。IFN為連接先天免疫與獲得性免疫的重要細胞因子，主要有I型（IFN/β）及II型（IFN）干擾素。IFN的抗病毒機制主要是通過激活JAK-STAT信號通路，促使抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄及信號通路的活化。干擾素作為廣譜抗病毒藥已廣泛用于HCV及HBV的治療。對HCV的治療顯示IFN的療效與病毒的基因型有很大的關(guān)系：對基因1型HCV的療效達42%～46%，對基因2型及3型的應(yīng)答率達76%～80%。宿主的因素在IFN的療效中同樣非常重要，對同時接受治療的應(yīng)答和無應(yīng)答病人的肝穿刺標(biāo)本研究顯示宿主的某些基因的基礎(chǔ)表達水平與IFN療效高度相關(guān)。為了延長IFN的半衰期，新一代的臨床使用的IFN進行了聚乙二醇修飾，修飾后的IFN可以延長其作用時間，同時可以提高肝內(nèi)的局部藥物濃度，提高IFN的治療效果。臨床上有研究者聯(lián)合使用I型和II型干擾素治療HCV無應(yīng)答的病人取得了良好的效果。Toll樣受體是機體識別外源或異己的模式識別受體，通過識別微生物的某些組分如核酸、脂類的特異模式（如LPS,CpG）而啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)IFN及NF-κB的激活，進一步啟動獲得性免疫，為宿主抵御病原微生物的第一道防線。利用TLR的配體在體內(nèi)激活TLR信號通路，可能通過調(diào)節(jié)機體免疫狀態(tài)，達到清除病毒的目的。已有報道在HCV持續(xù)感染的病人中利用TLR7的配體達到抑制病毒的效果，體內(nèi)TLR7的激活可能通過誘生I型IFN，促炎因子及共刺激分子的上調(diào)，增強獲得性免疫，產(chǎn)生增強的抗病毒免疫狀態(tài)從而達到抑制病毒的效果?？共《狙搴捅N球蛋白是傳統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)治療方法，但是其來源有限效能不高。近年來，利用細胞融合技術(shù)、基因工程技術(shù)等生產(chǎn)的單克隆抗體為免疫調(diào)節(jié)治療提供新的思路。常見的抗體設(shè)計思路包括構(gòu)建雙特異性抗體、嵌合抗體、抗獨特型抗體和雙功能抗體。不同類型構(gòu)建人工單克隆抗體，或是封閉病毒感染所