血清中米酵菌酸的測(cè)定 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（征求意見稿）

GAIAxxx—xxxx血清中米酵菌酸的測(cè)定超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了血清中米酵菌酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定性定量檢測(cè)方法。標(biāo)準(zhǔn)適用于血清中米酵菌酸的定性、定量分析。其他可疑樣品中米酵菌酸的定性、定量分析可參照使用。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定WS/T679突發(fā)中毒事件衛(wèi)生應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范總則3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理樣品用0.1%氨水甲醇－乙腈溶液（80∶20，v/v）提取，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，以保留時(shí)間、質(zhì)譜特征碎片離子峰和相對(duì)豐度比作為定性判斷依據(jù)，以峰面積為定量依據(jù)，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。5試劑與材料5.1試劑5.1.1乙腈（CH3CN）：色譜純。5.1.2甲醇（CH3OH）：色譜純。5.1.3甲酸（CH2O2）：色譜純。5.1.4氨水（NH4OH）：色譜純。5.2試劑配制搖勻。5.2.20.05%甲酸水溶液：取5mL甲酸，用水定容至1000mL，搖勻。3GAIAxxx—xxxx5.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配置5.3.1米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10.0mg/L）：根據(jù)米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)固體，用甲醇配制成10.0mg/L米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，-20℃避光保存，有效期6個(gè)月?；虿捎檬惺塾凶C標(biāo)準(zhǔn)溶液配置。5.3.2米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（200μg/L準(zhǔn)確吸取米酵菌酸中間溶液（5.3.1）200μL于10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到濃度為200μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，-20℃避光保存。5.3.3米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：準(zhǔn)確吸取米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（5.3.2），用初始流動(dòng)相逐步稀釋成濃度為0.50μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。5.4材料5.4.1具塞塑料離心管：2mL。5.4.2吸管：5mL。5.4.3微孔濾膜（有機(jī)相）：0.22μm6儀器和設(shè)備6.1超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：配電噴霧離子源（ESI）和三重四極桿質(zhì)量分析器。6.2離心機(jī):轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。6.3渦旋震蕩器。6.4精密移液器。6.5生物安全柜。7試樣的采集、保存和運(yùn)輸試樣的采集、保存和運(yùn)輸應(yīng)符合WS/T679-2020中的第8章要求。8分析步驟8.1個(gè)人防護(hù)在處理樣本時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵從對(duì)潛在生物傳染性樣本處理的相關(guān)規(guī)定，使用時(shí)遵循生物安全規(guī)則，于生物安全柜中對(duì)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并根據(jù)規(guī)定對(duì)廢物進(jìn)行處理，做好相應(yīng)個(gè)人防護(hù)。8.2提取準(zhǔn)確移取血清樣品0.2mL于2mL塑料離心管中，加入1mL0.1%氨水甲醇－乙腈溶液（5.2.1渦旋2min，10000r/min離心5min，取上清液于2mL塑料離心管加入0.5mL正己烷渦旋混合，靜置2min后，取甲醇－乙腈層過0.22μm濾膜后上機(jī)。8.3儀器檢測(cè)8.3.1液相色譜參考條件a）色譜柱：AcquityBEHC18色譜柱（2.1×50mm，1.7μm），或相當(dāng)者。4GAIAxxx—xxxxb）流動(dòng)相：A為0.05%（v/v）甲酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫條件見表1。表1液相色譜梯度洗脫條件時(shí)間（min）A（%）B（%）0.0703070303.06.0907.05957.170309.07030c）流速：0.3mL/min。d）柱溫：40℃。e）進(jìn)樣量：5μL。8.3.2質(zhì)譜儀參考條件a）離子源：電噴霧離子源（ESI）。b）毛細(xì)管電壓：-2.5kv；去溶劑溫度：500℃。c）掃描方式：負(fù)離子掃描。d）檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）。e）霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣由氮?dú)獍l(fā)生器產(chǎn)生或使用高純氮?dú)?、碰撞氣均為高純氬氣；使用前?yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求。f）錐孔電壓、碰撞能量等電壓值優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度。g）定性離子對(duì)、定量離子對(duì)，錐孔電壓及碰撞能量見表2。表2米酵菌酸的質(zhì)譜參數(shù)化合物保留時(shí)間(min)離子對(duì)(m/z)錐孔電壓(V)碰撞能量(eV)米酵菌酸4.37定量：485.2>441.2-22-12定性：485.4>397.3-22-188.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精確吸取5μL的米酵菌酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.3.3），由低濃度到高濃度依次注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)行測(cè)定。以米酵菌酸定量用子離子的質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖參見附錄A圖A。8.3.4定性測(cè)定在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，被測(cè)試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間相比較，相對(duì)誤差應(yīng)在±2.5%之內(nèi)，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子豐度比相一致（相對(duì)豐度＞50%，允許±20%偏差；相對(duì)豐度20%～50%，允許±25%偏差；相對(duì)豐度10%～20%，允許±30%偏差；相對(duì)豐度≤10%，允許±50%偏差則可判斷樣品中存在米酵菌酸。5GAIAxxx—xxxx8.3.5定量測(cè)定本標(biāo)準(zhǔn)采用外標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定，定量用標(biāo)準(zhǔn)溶液采用同種基質(zhì)配置，且所測(cè)樣品中米酵菌酸的相應(yīng)值應(yīng)在儀器的線性范圍內(nèi)，如果試樣待測(cè)液中被測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)值超出儀器檢測(cè)的線性范圍，可適當(dāng)稀釋后測(cè)定。8.4空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按照上述測(cè)定步驟進(jìn)行。9結(jié)果計(jì)算和表述試樣中米酵菌酸的含量C按式（1）計(jì)算。式中：C──待測(cè)組分含量(μg/L）；C0──由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣液中被測(cè)組分濃度(μg/L）；V──樣品定容體積（mL）；V0──樣品取樣體積（mL）；注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。測(cè)定結(jié)果用兩次平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。10方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度10.1靈敏度本方法檢出限為1.0μg/L，